研究背景：阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)又称老年性痴呆症,是好发于中老年人的一种神经系统退行性疾病,为最常见的痴呆类型。随着人口老龄化进程的加快,老年性痴呆发病率也逐年升高,其居高不下的致死率及致残率给患者、家庭和社会造成严重的心理和经济负担。如何防治这一类疾病已成为当今医学科学重点研究的课题之一。老年性痴呆在病理上以神经细胞外存在老年斑(senile plaque, SP)、细胞内出现神经原纤维缠结(neurofibillary tangle, NFT)、皮层神经元减少以及新皮层和脑膜血管出现淀粉样变等为特征。在临床上老年性痴呆以隐袭起病、缓慢进展、逐渐加重,尤其以记忆力的减退和丧失、语言和行为障碍、思维能力下降以及认知功能障碍等为主要临床特征。目前,“Aβ假说”被广泛地接受为老年性痴呆最主要的发病机理之一。该假说认为Aβ聚集和沉积是AD发病的中心环节,多种病因引起β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein)代谢异常,表现为Aβ产生过多或降解减少,Aβ在特定脑区聚集沉淀,引发各种免疫炎症反应和神经毒性级联反应,造成突触损伤和神经元死亡,从而导致老年性痴呆患者的记忆力减退和认知功能障碍等症状产生。虽然AD不被认为是经典的炎症或免疫反应介导的疾病,但大量的实验证据和临床资料证明老年性痴呆的发生与机体免疫功能的异常之间有着密切的关系。当Aβ清除机制受损,致使Aβ沉积形成免疫原,激活了机体免疫反应。研究证实在AD患者脑内有强烈的炎症反应发生,有资料显示AD动物模型和AD患者的体液免疫及细胞免疫功能均有异常,Aβ实验性免疫治疗的功效进一步证实了AD发病的免疫炎症机理,主动免疫不仅产生了特异性抗Aβ抗体,阻止和减少了淀粉样斑块的形成,而且还减轻了AD的临床症状、提高了接种鼠的认知能力。但是少数病人在接种疫苗后出现了脑膜脑炎等副作用,在后来的尸检中还发现患者脑膜中有大量自身反应性T细胞和巨噬细胞浸润现象等。AD发病的免疫炎症机制和Aβ免疫治疗的效果启发我们思考：既然由Aβ沉积引发的免疫炎症反应参与了AD的发病过程,那么细胞免疫在AD病理中发挥了何种功能?特别是T细胞在AD病理过程中有何作用?AD的最终病理结局是脑神经元凋亡或死亡而减少,那么T细胞的存在与否对脑神经元凋亡和新生是否影响?如有影响其发挥作用的机制可能是什么?目前,T细胞在老年性痴呆中对神经元凋亡和再生的影响还没有直接证据,其机制也不清楚。本课题将对以上问题开展初步研究,为揭示AD的发病机制而进行基础性的研究和探索。目的：为探究T细胞在阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)发病机理中对脑海马神经元凋亡和再生的影响及其分子机制。1.建立模拟AD的BALB/c小鼠动物模型。包括免疫功能正常的模拟AD小鼠动物模型和T细胞免疫缺陷的模拟AD小鼠动物模型,并对这种新建立的动物模型进行病理学评价。2.利用所建立模拟AD的BALB/c小鼠动物模型,探讨T淋巴细胞在AD模型鼠中对小鼠脑海马神经元凋亡和再生的影响作用。3.应用荧光定量PCR技术,探究在AD模型鼠中T细胞对海马神经元凋亡和再生影响的可能分子机制。方法：1.选取BALB/c正常小鼠(BALB/c-WT)和T细胞缺陷的BALB/c裸小鼠(BALB/c-nude)各24只,随机分为实验组和对照组。利用显微注射方法分别在实验组和对照组小鼠双侧海马CA1区注射寡聚态Aβ1-42和生理盐水(NS)。实验组又分为两组,即实验I组(BALB/c-WT+Ap1-42)和实验II组(BALB/c-nude+Ap1-42),对照组也分对照I组(BALB/c-WT+NS)和对照II组(BALB/c-nude+NS),每组12只,4组共48只。建立模拟AD的BALB/c小鼠动物模型。于造模后的第7d、21d二个时间点分批次分别取各组模型鼠的脑组织和外周血。2.HE染色,在光镜下观察并比较实验组(Aβ1-42-injection)与对照组(NS-injection)注射部位的脑组织及周围的炎症反应情况；免疫组织化学显色检测Aβ1-42在实验组小鼠脑内沉积表现。3.利用免疫组织化学方法,于造模21d时,分别检测实验组和对照组小鼠海马神经元内与凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达情况；用TUNEL法进一步检测各组小鼠海马神经元发生凋亡的情况。4.采用同样方法,于造模7d时,用微管结合蛋白(Doublecortin, DCX)抗体特异性标记海马齿状回增殖的神经前体细胞,分别检测实验组和对照组小鼠脑海马神经前体细胞再生的情况。5.用荧光定量RT-PCR方法,分别检测并比较造模后的第7d和21d实验组与对照组小鼠外周血中的IL-2、 IFN-γ的基因表达和脑组织IL-1β和TNF-α的基因表达情况。6.应用Image pro-plus6.0图像分析系统软件,分别将各组测量所得的DCX、Bcl-2、Bax和TUNEL法标记的阳性产物平均光密度值,应用SPSS16.0统计分析软件,将数据分别进行单因素方差分析(One-way ANOVA),进行组间多重比较；将荧光定量RT-PCR检测所得的基因表达数据作重复测量方差分析,不同时间两组比较用t检验；均以P<0.05,认为结果有统计学意义。结果：1.通过HE染色,7d时在光镜下可以观察到注射Aβ1-42部位的脑组织周围出现明显的神经毒性表现。实验组(Aβ1-42-injection)与对照组(NS-injection)相比,实验组脑组织炎症损伤范围扩大,炎症损伤区及周围神经元有变性死亡情况出现。免疫组织化学方法检测结果显示,在实验组小鼠脑内有Aβ1-42阳性产物存在,而对照组小鼠脑内无Aβ1-42阳性产物出现。2.免疫组织化学染色结果显示：造模21d时,各组间Bcl-2的蛋白表达有差别(F=368.159,P=0.000)。其中正常小鼠(BALB/c-WT)与裸小鼠(BALB/c-nude)相比,其海马区抑凋亡基因Bcl-2的蛋白表达较强,二者之间有显著性差异(P<0.01),说明T细胞的存在能促进Bcl-2基因的蛋白表达而抑制凋亡发生。各组间Bax蛋白表达也有差别(Welch F=89.723,P=0.000),裸小鼠(BALB/c-nude)与正常小鼠(BALB/c-WT)相比,其海马区促凋亡基因Bax的蛋白表达强,二者之间也有显著性差异(P<0.01),提示T细胞缺乏可能促进Bax基因的蛋白表达而促进凋亡的发生。TUNEL检测凋亡的结果也显示,各组间有差别(WelchF=293.549,P=0.000),当T细胞正常时海马神经元的凋亡现象减少；当T细胞缺乏时海马神经元的凋亡现象增加。实验结果还显示,实验组(Aβ1-42注射组)和对照组(NS注射组)相比,小鼠海马区神经元凋亡现象明显增强,提示注射Aβ1-42可导致海马神经元的损伤而引起神经元凋亡的发生。3.神经元微管结合蛋白(Doublecortin, DCX)能特异性标记增殖的神经元前体细胞。造模7d时各组间DCX表达有差别(F=460.707,P=0.000)。在实验组(Aβ1-42-injection)和对照组(NS-injection)组小鼠海马齿状回的颗粒细胞下层(SGZ)均可见到数量不等的DCX标记的阳性细胞,DCX阳性细胞形态典型,突起明显,主要集中在海马齿状回的颗粒细胞下层(SGZ)。正常小鼠(BALB/c-WT)的阳性细胞数量多于裸小鼠(BALB/c-nude),统计结果显示：实验I组和对照I组与实验II组相比、实验II组与对照II组相比,均有显著性差异(P<0.01)。结果提示T细胞的存在对神经元的再生有促进作用,这就比较直接地证明了T细胞在神经元再生方面有一定的促进作用。而在相同小鼠中,实验组(Ap1-42-injection)与对照组(NS-injection)相比,海马齿状回颗粒细胞下层(SGZ)的DCX阳性细胞明显减少,提示Aβ1-42的神经毒性对脑海马神经元再生有抑制作用。4.荧光定量PCR检测外周血和脑组织中相关细胞因子的基因表达结果各组间相关细胞因子的基因表达均有差别(P=0.000)。在外周血中,正常小鼠(Balb/c-WT)与裸小鼠(Balb/c-Nude)相比,实验组和对照组的IL-2、IFN-γ基因表达在7d和21d两个时间点均增加,有显著性差异(P<0.01)。随着时间增加,正常小鼠(Balb/c-WT)IL-2基因表达均下调(P<0.01)；裸小鼠在实验组和对照组IL-2基因表达变化不一致；实验组小鼠(Aβ-injection) IFN-γ基因表达有明显下调(P<0.01)；而对照组(NS-injection)外周血中的IFN-γ基因表达变化不明显。在脑组织中,正常小鼠(Balb/c-WT)与裸小鼠(Balb/c-Nude)相比, IL-1β基因表达在7d、21d两个时间点均增加,其中实验组与对照组相比IL-1β表达增加显著(P<0.01)；随着时间变化,正常小鼠(Balb/c-WT)脑组织中的IL-1β基因表达变化有差异性(P<0.01)；而裸小鼠(Balb/c-Nude)随着时间变化,IL-1p基因表达变化无差异性(P>0.05)。正常小鼠(Balb/c-WT)与裸小鼠(Balb/c-Nude)相比,7d时实验组和对照组的TNF-α基因表达增加(P<0.01),21d时实验组TNF-α基因表达增加而对照组该基因表达变化不明显。结论：1.利用BALB/c正常小鼠和T细胞免疫缺陷的BALB/c裸小鼠,通过海马注射Aβ1-42淀粉样蛋白可以建立模拟AD动物模型。新建立的动物模型在一定程度上模拟出老年性痴呆的主要病理表现,如在脑内出现Aβ1-42沉积和神经毒性炎性反应等。2.在AD模型鼠中,T细胞的存在与海马神经元的凋亡和再生之间有着一定的关系。正常的T细胞对海马神经元的凋亡有抑制作用,而对海马神经元新生有促进作用；T细胞缺乏能促进海马神经元凋亡的发生,抑制海马神经元的新生。另外脑内注射Aβ1-42可导致脑海马神经元凋亡增加、新生减少,这可能与Aβ1-42的神经毒性作用抑制了海马神经元再生、促进神经元凋亡有关。3.在AD模型鼠中,T细胞的存在对海马神经元凋亡和再生均具有明显的影响作用,但这种影响机制是如何实现的目前还不清楚。T细胞与中枢小胶质细胞之间可能存在一种近似交叉对话(Cross-talking)的复杂关系,这种影响作用可能通过激活外周T细胞和中枢小胶质细胞,导致相关细胞因子如IL-2、 IFN-γ、IL-1β和TNF-α等的表达改变,最终在多种细胞因子共同作用下,来实现对神经元凋亡和新生的调控和影响。主要创新点：1.建立了一种新的模拟AD的动物模型。选取BALB/c正常小鼠(BALB/c-WT)和T细胞缺陷的BALB/c裸小鼠(BALB/c-nude),通过显微注射的方法建立了模拟AD的动物模型,经组织学检测该模型能模拟出AD主要病理表现。2.利用该模型进行研究证实：T细胞的存在对小鼠脑海马神经元的凋亡具有抑制作用,对小鼠海马神经元的再生具有促进作用。3.进一步研究显示,在AD模型鼠中,T细胞对海马神经元凋亡和再生的影响作用,可能与外周T细胞相关因子(如IL-2和IFN-γ)以及脑内小胶质细胞相关因子(如IL-1β和TNF-α)的表达改变有关。4.本项研究对揭示AD发病的免疫学机理和临床上AD的免疫治疗均具有一定的积极意义。