研究背景：骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)是最常见的骨肿瘤,约占所有原发性骨肿瘤的15%。在原发性恶性骨肿瘤中,骨肉瘤发病率紧随在多发性骨髓瘤后排名第二。每年骨肉瘤在人群中的发病率约为3例/百万人口,约占所有恶性肿瘤的0.2%。15至25岁的骨肉瘤患者约占所有患者的75%,男性比女性发病率更高,约为1.5：1。骨肉瘤主要发生于6岁到60岁的人群。一般来说,80%到90%的骨肉瘤发生在长管骨。股骨、胫骨、肱骨占肢端肿瘤的85%左右,而手和脚部骨骼占不到1%。长骨骨肉瘤通常起源于干骺端。尽管包括病毒起源说、电离辐射等学说可以解释部分骨肉瘤的发病与进展,但骨肉瘤的病因及发生发展机制至今仍不清楚。近几十年以来,随着对骨肉瘤研究的深入及新药的开发,新的放、化疗方法及新的手术方式不断出现,骨肉瘤的治疗理念已经涵盖了多个学科的治疗方法。新近研究发现了多个骨肉瘤相关的关键基因包括P53、FAS、NOTCH等,基于这些肿瘤相关信号通路的基因靶向治疗为骨肉瘤的预防和治疗提供新的策略和途径。在骨肉瘤的诊断治疗领域,尽管每年都有新的成果的出现,但衡量骨肉瘤患者治疗效果的5年生存率仍然只能维持在60-70%。因此,发现一个能准确预测骨肉瘤发生、发展、转移和对化疗反应性,并可有效调控骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的新型标志物对于理解骨肉瘤的发病机制,并寻找有效防控靶点具有极其重要的意义。内脏脂肪素(Visfatin)最早也称为前B细胞集落增强因子(PBEF)、烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt),是由人类外周血淋巴细胞分泌的,参与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的代谢。拥有三种不同生物学名字及三个不同功能,使该蛋白质非常特别。内脏脂肪素分子量为52kDa,二聚体时具有活性,每个单体含有491个氨基酸。已证实,在人类,内脏脂肪素/PBEF/Nampt该基因位于7染色体的长臂77q22.1和7q31.33之间。Visfatin基因在进化中高度保守。Visfatin在骨髓、肝脏和肌肉等组织中表达最多,其次是大脑、肾、脾、睾丸、肺,但在内脏脂肪中多于皮下脂肪。Visfatin被认为是一个新的促炎脂肪细胞因子,它可剂量依赖性上调包括单核巨噬细胞、脂肪细胞及肿瘤细胞中多种细胞因子如IL-1、IL-1Rα、IL-6、IL-10和TNF-a等表达,而这些细胞因子在炎症性疾病及肿瘤中均发挥了实质性作用。最近的研究发现,细胞内NAD+的增加、烟酰胺表达水平的减少及去乙酰酶sirtuin蛋白家族的水平改变对于细胞的生存非常重要,而内脏脂肪素则通过激活sirtuins途径及烟酰胺途径,延长细胞寿命并促进细胞的成熟,因此,内脏脂肪素可间接有助于细胞寿命的长寿。然而,Visfatin是否能够在骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭过程中发挥作用,至今尚未报道。上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)作为人体组织上皮细胞向间充质转化的一种特殊生物学过程,在包括胚胎发育、伤口愈合及恶性肿瘤在内的多个生理病理状态进展过程中发挥极其重要的作用。在上皮间充质转化的过程中,有极性的上皮表型细胞在各种生理病理刺激下逐渐转变为具有高度运动特性的间叶性表型细胞。在这一过程中,细胞上皮表型标志物如E-cadherin的表达逐渐减少,而间充质表型的标志物如N-cadherin的表达却逐渐增加。此前多项体外及体内研究均表明,上皮间充质转化在恶性肿瘤的增殖、迁移及侵袭等过程中发挥了重要作用。在肿瘤侵袭和转移过程中,肿瘤细胞隐藏其已分化的上皮特性包括细胞间粘附和极性,而获得间充质细胞特性如运动性、侵袭性以及更为重要的干细胞属性。上皮间充质转化过程是可逆的,间充质上皮可以分化为上皮表型,而上皮表型同样可以分化为间充质表型。异常微环境条件如缺氧、低pH值或营养不足可引起肿瘤细胞内的一系列反应,包括代谢适应、表观遗传改变以及EMT相关的去分化。这最终将导致肿瘤细胞转移到远处的组织和器官,从而可提供必要的营养支持来维持快速增长。以上对上皮间充质转化过程的研究可为癌症的预防及治疗提供一个方法。然而其在骨肉瘤发生发展过程中的作用至今研究尚处于起步阶段。综上所述,侵袭和迁移是骨肉瘤进展过程中的一个重要环节,是导致骨肉瘤预后不良的一个重要因素,因此对侵袭和迁移机制的研究对防治骨肉瘤具有重要意义。多种癌症的发病伴随着Visfatin表达水平的升高,迄今为止还没有直接证据表明Visfatin参与了骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。因此,鉴于上述实验研究,我们旨在评估Visfatin是否影响骨肉瘤细胞的迁移和侵袭,并探寻其潜在的分子机制。研究目的1.探讨Visfatin对骨肉瘤细胞迁移和侵袭的影响；2.探讨Visfatin在骨肉瘤细胞中对上皮-间充质转化的影响；3.探讨Visfatin影响骨肉瘤细胞迁移和侵袭的相关信号转导通路。研究方法：1.细胞培养U20S细胞所用培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基,于含5% CO2的37℃孵箱中孵育。为确定Visfatin对EMT标志物表达的影响,U20S细胞在含1%胎牛血清的DMEM中维持培养12h,随后添加Visfatin或其他试剂继续培养。2.细胞迁移实验伤口愈合试验被用来测定细胞的迁移。U20S细胞以1×106/孔的密度接种于6孔板,生长融合为单层细胞。用吸管以相同宽度的直线在U20S单层细胞产生划痕。加入试剂后孵化一定时间,在显微镜下测量伤口愈合。3.细胞侵袭实验基质胶覆盖的Transwell实验被用来测定细胞的侵袭。改良的Boyden小室插有8μm孔隙的过滤器,并在表面覆以基质胶(50μg.孔)。U20S细胞培养在24孔板中,上层小室内的细胞用含1%胎牛血清的DMEM培养,而下层小室内的细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养。上室内悬浮的细胞(1×105/孔)培养在含5% CO2的37℃孵箱中。孵育24h后,已经侵袭到基质膜下面的细胞经由甲醇固定30min,并以结晶紫染色,仍停留在上表面的细胞被拭去。4. Western blot实验用Visfatin和其他试剂刺激后,收集U20S细胞,蛋白质用含1 mM PMSF的RIPA裂解液于冰上裂解30min。提取的蛋白用BCA蛋白试剂盒测定浓度。细胞蛋白置于10% SDS聚丙烯酰胺凝胶,加入蛋白提取物,在90v条件下进行电泳60-90min后,将10% SDS聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白转移至NC膜上。5%脱脂牛奶封闭抗原位点后,加入一定浓度的适量的一抗,在4℃条件下孵育过夜。然后取出条带,TBST清洗三次后,配制一定浓度的二抗,在室温条件下孵育条带约2h。最后,将这些含有蛋白印迹的条带通过电化学发光显示,检测条带亮度并进行分析。5.实时定量PCR(qPCR)分析分离细胞中的总RNA,并使用Trizol试剂提取。总RNA浓度用分光光度法测定。用M-MLV使RNA样本逆转录为cDNA,以18s作为内参。实时PCR基因的引物序列如下：E-钙粘蛋白正向序列5’-ACCAGAATAAAGACCAAGTGACCA-3’,反向序列5’-AGCAAGAGCAGCAGAATCAGAAT-3’; N-钙粘蛋白正向序列5’-CACTGCTCAGGACCCAGAT-3’,反向序列5’-TA AGCCG AGTGATGGTCC-3’; Snail正向序列5’-TTGGATACAGCTGCTTTGAG-3’,反向序列5’-ATTGCATAGTTAGTCACACCTC-3’; 18s内参正向序列5’-CTTAGTTGGTGGAGCGATTTG-3’,反向序列5’-GCTGAACGCCACTTGTCC-3’.6.统计学分析本研究数据均应用SPSS18.0软件处理。数据采用均数±标准差(mean±SD)表示。符合正态分布及方差齐性的数据采用两独立样本t检验或单因素方差分析,两两比较采用最小显著性差异检验；若数据不符合正态性和(或)方差齐性,两组比较采用Wilcoxon秩和检验,多组则采用Kruscal-Wallis秩和检验,多重比较时检验水准采用Bonfferoni校正(α’=α/k,k为多重比较次数)。检验水准α=0.05,P<α或α’则认为具有统计学差异。研究结果1. Visfatin对骨肉瘤细胞迁移的影响U20S骨肉瘤细胞经过培养后,将其随机分为Control组和Visfatin组,对这两组细胞分别进行伤口愈合实验(划痕实验),其中Visfatin组细胞给予500ng/ml的重组Visfatin,而对照组则给予等体积的生理盐水。经过24小时后,对划痕部位拍照、记录,得到以下数据：Control组与Visfatin组细胞相对迁移距离百分比分别是(100±7)%,(255.67±43.50)%；经统计学分析,得出二者差异有统计学意义(t=-6.12,P<0.01)。2. Visfatin对骨肉瘤细胞侵袭的影响同样对培养的U20S骨肉瘤细胞随机分为Control组和Visfatin组进行Transwell实验,其中Visfatin组细胞给予500ng/ml的重组Visfatin,而对照组则给予等体积的生理盐水。分别经过12小时和24小时刺激后,对小室底面的细胞行龙胆紫染色,并在显微镜下进行计数。12小时,Control组与Visfatin组相对侵袭细胞数目百分比分别是(100±7)%,(121.33±16.56)%,经统计学分析,得出二者差异无统计学意义(t=2.01,P=0.11)。24小时,Control组与Visfatin组相对侵袭细胞数目百分比分别是(100±7)%,(214±24.27)%,经统计学分析,得出二者差有统计学意义(t=7.82,P<0.01)。3. Visfatin对骨肉瘤细胞EMT标记物表达的影响我们用Western blot和实时PCR分别来检测Visfatin对EMT标记物及其mRNA表达的影响。不同浓度的Visfatin(5、50和500ng/ml)分别刺激骨肉瘤细胞并培养24h,之后检测到对照组及不同浓度的Visfatin刺激骨肉瘤细胞后所表达的E-cadherin蛋白倍数、N-cadherin蛋白倍数、E-cadherin mRNA倍数和N-cadherin mRNA倍数分别是：0.99±0.11,0.88±0.09,0.58±0.10,0.38±0.08；0.99±0.07,1.51±0.13,2.60±0.29,3.28±0.59；0.99±0.11,0.82±0.07,0.48±0.10,0.39±0.09；0.99±0.07,1.48±0.12,4.20±0.64,5.45±0.90。经统计分析发现随着Visfatin浓度的增加,E-cadherin表达逐渐降低,差异有统计学意义(F=27.07, P<0.01)。N-cadherin表达逐渐增加,差异有统计学意义(X2=20.57, P<0.01)。E-cadherin mRNA表达逐渐降低,差异有统计学意义(F=27.51, P<0.01), N-cadherin mRNA表达逐渐增加(χ2=20.75,P<0.01),差异有统计学意义。再将500 ng/ml的Visfatin添加到骨肉瘤细胞,分别培养6h、12h、24h、48h,之后检测到对照组及不同时间长度的Visfatin刺激骨肉瘤细胞后所表达的E-cadherin蛋白倍数、N-cadherin蛋白倍数分别是：0.99±0.11,0.95±0.06,0.72±0.07,0.51±0.05,0.38±0.08：0.99±0.07,1.05±0.09,1.80±0.12,3.01±0.31,3.51±0.43。再将500 ng/ml的Visfatin添加到骨肉瘤细胞,分别培养3h、6h、12h、18h、24h,之后检测到对照组及不同时间长度的Visfatin刺激骨肉瘤细胞后所表达的E-cadherin mRNA倍数和N-cadherin mRNA倍数分别是：0.99±0.11,0.95±0.06,0.75±0.13,0.52±0.07,0.33±0.06,0.31±0.09；0.99±0.11,1.03±0.09,2.38±0.38,4.62±0.64,6.94±0.43,6.72±0.47。经统计分析发现随着随着时间延长,E-cadherin蛋白表达水平逐渐下降(F=38.17, P<0.01); N-cadherin蛋白变化趋势呈上升趋势(F=126.53, P<0.01), E-cadherinmRNA表达逐渐降低(F=35.37,P<0.01),N-cadherinmRNA表达逐渐升高(F=134.35,P<0.01),有统计学意义。4. Visfatin对Snail表达的影响及Snail siRNA对EMT标记物表达的影响我们将500 ng/ml的Visfatin添加到骨肉瘤细胞中,分别培养3h、6h、9h和12h,之后检测到对照组及不同时间长度Visfatin刺激骨肉瘤细胞后所表达的Snail蛋白倍数和Snail mRNA倍数分别是：0.99±0.11,1.02±0.16,2.25±0.44,2.36±0.46,2.38±0.58；0.99±0.11,1.16±0.19,4.18±0.67,4.06±0.60,4.37±0.82。经统计分析发现随着随着时间延长,Snail蛋白表达水平明显上升(F=10.32,P<0.01),SnailmRNA表达也明显升高(F=29.06,P<0.01),差异有统计学意义。之后,为确定Snail在促进EMT中的作用,骨肉瘤细胞随机分为三组：Control组、Visfatin组、Visfatin+Snail siRNA组。24小时后,测得三组E-cadherin蛋白和N-cadherin蛋白表达量分别是：1±0.08,0.37±0.09,0.69±0.08; 1±0.07,2.74± 0.16,1.64±0.15。E-cadherin蛋白表达量三组间差异明显(F=44.33,P<0.01),有统计学意义,N-cadherin蛋白表达量三组间差异明显(F=134.54,P<0.01),也有统计学意义。5.Visfatin对骨肉瘤细胞NF-κB核转位的影响将500 ng/ml的Visfatin添加到骨肉瘤细胞中,分别培养3h、6h、9h和12 h,检测到对照组不同时间点Visfatin刺激骨肉瘤细胞后核内NF-K B的p65多肽表达倍数和核外胞浆中NF-κB的p65多肽表达倍数分别是：0.99±0.11,1.87±0.29,2.25±0.57,5.36±0.06,5.52±0.64；0.99±0.11,0.67±0.09,0.45±0.09,0.40±0.06,0.30±0.11。经统计分析发现随着时间延长,核内p65表达水平显著增加(F=55.02,P<0.01),核外p65表达水平显著降低(F=26.79,P<0.01)。6.Bayll-7082对骨肉瘤细胞EMT标记物及Snail表达的影响为了进一步明确Visfatin诱导的促进和抑制EMT标记物表达的分子机制,将骨肉瘤细胞随机分为三组：Control组、Visfatin组、Visfatin+Bay11-7082组。24小时后,三组E-cadherin蛋白和N-cadherin蛋白表达量分别是：1.00±0.07,0.27±0.08, 0.72±0.17; 0.99±0.05,4.45±0.48,2.36±0.34。E-cadherin蛋白表达量三组间差异明显,有统计学意义(F=29.70, P<0.01), N-cadherin蛋白表达量三组间差异明显,也有统计学意义(F=157.14,P<0.01)。相同处理后,三组Snail的蛋白表达情况分别是Control组0.99±0.05, Visfatin组5.09±0.85, Visfatin+Bay11-7082组2.22±0.41,三组间表达差异有统计学意义(χ2=15.16,P<0.01)。7.Visfatin/Bay11-7082/Snail siRNA对骨肉瘤细胞迁移与侵袭的影响骨肉瘤细胞分别用不同浓度的Visfatin(5、50和500ng/ml)刺激24h后分别进行伤口愈合实验和Transwell实验,对照组及不同浓度的Visfatin刺激后骨肉瘤细胞相对迁移距离百分比和骨肉瘤细胞相对侵袭细胞数目百分比分别是：(100±7)%,(103.67±7.57)%,(176±22.11)%,(255.67±43.50)%；(100.50±4.63)%,(103.67±5.05)%,(167.17±5.85)%,(213.83±15.51)%。经统计分析发现随着Visfatin浓度的增加,骨肉瘤细胞相对迁移距离百分比增大,差异有统计学意义(F=26.01,P<0.01)；骨肉瘤相对侵袭细胞数目百分比增多,差异有统计学意义(F=221.61,P<0.01)。将骨肉瘤细胞随机分成4组,Control组、Visfatin组、Visfatin+Bay11-7082组及Visfatin+Snail SiRAN组。对四组骨肉瘤细胞进行伤口愈合实验和Transwel实验,它们的细胞相对迁移距离百分比和相对侵袭细胞数目百分比分别是：(100±7)%,(263.67±36.69)%,(152.67±10.02)%,(146.67±16.80)%；(100.50±4.64)%,(206.00±15.63)%,(136.33±10.19)%,(127.67±11.20)%。4组细胞相对迁移距离百分比Visfatin组最高,Visfatin+Bay11-7082组及Visfatin+Snail组相似,但均高于Control组,差异有统计学意义(F=32.50,P<0.01)；4组的相对侵袭细胞数目百分比Visfatin组最高, Visfatin+Bay11-7082组及Visfatin+Snail组相似,均高于Control组(F=97.80,P<0.01)。结论1.Visfatin可呈浓度和时间依赖性地促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭；2.Visfatin可呈浓度和时间依赖性地诱导上皮-间充质转化；3. Visfatin通过NF-κB/Snail/EMT信号通路促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。