紫花苜蓿赤霉素受体基因MsGID1b的克隆及功能分析

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紫花苜蓿(Medicago sativa L.)作为一种优质多年生豆科牧草,提高其产量一直是其主要的育种目标之一。赤霉素是影响植物生物量的主要因子,过表达其合成途径和信号途径的主要组分能有效提高植物生物量。赤霉素受体是介导赤霉素信号转导途径的重要组分,直接影响着赤霉素对植物体效应的发挥。本研究利用同源克隆的方法,首次从紫花苜蓿中克隆得到一个赤霉素受体基因,命名为MsGID1b。序列分析结果表明,该基因的开放阅读框长度为1053 bp,编码350个氨基酸,推测其蛋白质分子量为39.839 kDa,是一个无信号肽和跨膜结构的亲水性蛋白。蛋白质亚细胞定位服务器预测MsGID1b主要定位于细胞质和微体。序列比对结果表明,该基因与蒺藜苜蓿MtGID1b基因的核苷酸序列相似度为98%,氨基酸序列相似度为99%,且具有HSL家族典型的HGG和GXSXG保守结构域及GA、DELLA蛋白的结合位点。荧光定量PCR分析结果表明,该基因在紫花苜蓿各组织中的表达丰度依次为:根>盛花>初花>茎>叶>荚果;经GA3、ABA、NaCl、PEG和黑暗诱导后该基因表达上调,尤其是在GA3诱导下,MsGID1b的表达量一直维持在较高水平,表明该基因可能参与紫花苜蓿的抗逆调控。通过原核表达试验,成功构建pEASY-E2-MsGID1b原核表达重组质粒后转化大肠杆菌,并自动诱导其表达。SDS-PAGE电泳结果表明,pEASY-E2-MsGID1b重组质粒能在大肠杆菌中成功表达,且表达蛋白的大小与预测结果一致。通过酵母双杂交试验,成功构建酵母表达载体后转入酵母感受态细胞,缺陷培养基筛选结果表明,MsGID1b在GA3存在条件下,能与拟南芥DELLA蛋白AtRGA和AtGAI互作。成功构建pBI121-MsGID1b过表达载体,并通过农杆菌介导的花序浸染法将目的基因转入拟南芥中,经过抗性筛选及分子检测,获得T3代转基因植株。转基因拟南芥表现出株高增加,生长速度加快,干鲜重、角果数增加等表型,其中,角果数目为对照组的两倍,干鲜重显著增加。推测目的基因MsGID1b能促进植株的生长发育,尤其是对花和果实的发育有重要影响。
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