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背景 基因治疗最初是以治疗单基因遗传病为主，而现在已广泛用于治疗肿瘤。视网膜母细胞瘤（RB）作为因肿瘤抑制基因失活而导致细胞恶变的一大类恶性肿瘤的代表，已成为眼科学、肿瘤学、医学遗传学、细胞生物学及分子生物学等领域共同关注的研究热点，并已取得令人瞩目的成果。目前依据肿瘤发展的不同阶段，可单独或联合使用冷冻治疗、激光光凝、温热疗法、表层巩膜放疗板、外放疗、眼球摘除和化学疗法等治疗方法。随着分子生物学及基因工程技术的迅速发展，RB的基因治疗已成为肿瘤研究的重点。众多学者对自杀基因疗法进行了广泛的研究，在体内外实验中均产生良好的抗肿瘤效应，其他基因治疗方案的疗效评价尚处于初步阶段。建立一种易于观察、生物学行为更接近于临床病人的理想的动物模型，对于了解肿瘤的发生、发展过程及正确评价放疗、化疗等各种治疗方案十分重要，并将为肿瘤的基因治疗研究奠定基础。 随着肿瘤基础理论研究的不断深入，抗肿瘤新生血管生成疗法正在成为一项新的重要的抗肿瘤辅助治疗措施。VEGF和VEGFR因其在肿瘤血管生成中的重要作用，而成为抗肿瘤生物治疗的一个重要靶点。VEGF主要通过与VEGFR-2结合诱导内皮细胞趋化和有丝分裂，阻断VEGF／VEGFR途径被认为是一种有效抑制肿瘤血管生长的治疗方法。目前，可溶性VEGFR尚处于临床前研究阶段。以高效的基因转移技术针对可溶性VEGFR以实现抗肿瘤新生血管生成的策略就成为基因治疗的一大切入点。基因转移是未来治疗遗传性疾病、肿瘤等的一项重要手段，现有的体内基因转移方法存在这样那样的不足。与最常用的病毒载体相比，质粒DNA简便、经济、抗原性弱、可多次反复应用等优点。电穿孔基因转移技术是外源基因转移最为有效的一种非病毒载体法，其突出的优点是简便、高效，已广泛用于体外基因转移。本研究中，我们拟建立新型RB和脉络膜恶性黑色素瘤原位移植瘤模型，探讨VEGF／VEGFR途径在肿瘤生长中的作用，并针对VEGF／VEGFR途径探讨利用电穿孔技术转移基因治疗RB的可行性与有效性。 方法 1．新型视网膜母细胞瘤原位移植瘤模型的建立及生物学行为观察 将2μl稳定转导并持续表达GFP的视网膜母细胞瘤(HXO-Rb44-GFP)细胞悬液（细胞密度为4.5×108／ml～5.5×108／ml）注射到30只裸鼠双眼视网膜下腔。摘要术后利用荧光体视镜定期连续观察肿瘤生长情况，于不同时间点处死动物，取出各器官置于洁净玻片上，倒置荧光显微镜下观察视神经、颅底、肺、肝、肾、脾脏的肿瘤转移情况;并对移植瘤肿瘤组织作常规病理学及GFP的免疫组化染色检测分析。2.新型脉络膜恶性黑色素瘤原位移植瘤模型的建立及生物学行为观察 将2川稳定转导并持续表达GFP的OCM一1一GFP细胞悬液（细胞密度为4.5又1护/ml一5.5又107/ml）注射到40只裸鼠右眼视网膜下腔。手术后利用荧光体视镜定期连续观察肿瘤生长情况，分别于眼内期、眼外期及衰竭期处死动物，取出各器官置于洁净玻片上，倒置荧光显微镜下观察视神经、颅底、肺、肝、肾、脾脏的肿瘤转移情况;并对移植瘤肿瘤组织作常规病理学及GFP的免疫组织化学染色检测分析。3.视网膜母细胞瘤与脉络膜恶性黑色素瘤原位与异位移植瘤模型生物学行为的观察分析 相同条件下培养HXO一Rb44一GFP与HXO一Rb44;OCM一l一GFp与OCM一l细胞，绘制细胞生长曲线，比较其体外增殖速度，以观察GFP基因标记对肿瘤细胞株体外生长的影响。建立RB及脉络膜恶性黑色素瘤原位及异位移植瘤模型，定期观察移植瘤的生长及转移情况。分析比较两种肿瘤原位/异位移植瘤模型生长、转移等生物学行为的特点。免疫组织化学检测移植瘤肿瘤组织血管新生相关因子VEGF与VEGFRZ（Flk一1或KDR）的表达。并采用ELISA法检测细胞株HXO一Rb44一GFP与OCM一l一GFP所分泌的VEGF的水平。4.阻断VEGF浑EGFR途径对视网膜母细胞瘤移植瘤生长的基因治疗实验研究 通过体内外实验探讨SFlk一1对RB生长的抑制作用及机理。体外实验以阳离子脂质体介导转染表达质粒pcl一sFlk一l至HEK293细胞，24小时后收集细胞培养液，分别按l:l、2:l、3:l的比例与1640培养基混合后培养HXO一Rb44一GFP细胞，绘制细胞生长曲线。体内实验将lxl了人类RB细胞（Hxo一Rb44一GFP）悬液接种至40只裸鼠右后腿皮下建立RB移植瘤模型。治疗组利用电穿孔技术介导表达质粒pCI一sFlk一l（15抖g）、pCI一ExTek（15林g）联合转移至瘤体，对照组注射生理盐水后电击。每周一次，连续3次。从第1次治疗开始至第3次治疗后1周，每周两次定期测量肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线，计算抑瘤率。治疗组与对照组肿瘤组织的微血管密度（MVD）采用平滑肌肌动蛋白（S MA）免疫组织化学标一记后计数，然后作统计学分析。免疫组化检测肿瘤内VEGF及其受体Flk一1的表达，IHS评分后行统计学分析。摘要 结果1.视网膜母细胞瘤原位移植瘤模型肿瘤生长与转移的观察 利用体视显微镜可连续观察视网膜下肿瘤的生长情况:术后第12.9士0.8（n=50）天起，可以观察到视网膜下绿色荧光团，为增生的肿瘤组织，随后逐渐增大;术后第28