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皮肤作为人体最大的器官，是机体与外界接触的机械屏障，具有复杂的生理结构和多种重要生理功能。当皮肤遭受严重烧伤、创伤、感染及糖尿病顽固性皮肤溃疡等损害时，大面积皮肤缺损的修复成为棘手的难题。如何使种子细胞在最短时间内获得最大增殖，如何获取促进种子细胞扩增的细胞因子代用品且安全可靠，皮肤这种半开放创面上如何有效解决移植感染问题将是组织修复领域的研究焦点。 本研究目的：1．建立和完善皮肤细胞分离和纯化技术。2．将中西医结合治疗感染性开放骨折的特色中药应用于组织工程皮肤的构建；制备高效免疫活性的皮肤细胞诱导物，使自体皮肤细胞在体外大量扩增：构建载药皮肤工程支架，通过体外观察，为制备新型的具有良好组织相容性、生物安全性、抗感染性、便于使用和贮存的组织工程皮肤提供实验依据。 方法：1．取同窝兔4cm2梭形全层皮肤，0.38％中性蛋白酶（Dispase Ⅱ）／0.053％胰蛋白酶（Trypsin）—0.04％EDTA二步分离法获取单个表皮细胞（Keratinocyte，KC）、成纤维细胞（Fibroblast，FB）；对分离培养KC进行角蛋白19、β1整合素免疫组化染色鉴定。2．提取制备生肌液；对组方及单味药的离子浓度、有机物含量、微量元素含量进行分析；将其作为种子细胞刺激因素，分别用体外培养的KC、FB用MTT方法进行应用浓度筛选。3．考察明胶—壳聚糖复合材料的体内降解过程；构建细胞—载体支架复合物；分别用半定量观察、MTT定量方法、组织学观察、扫描电镜观察方法考察载体支架与细胞的生物相容性及载药后对细胞增殖的影响。4．应用所构建的细胞—载药支架复合物修复家兔皮肤缺损：进行大体及组织学观察，考察修复效果。 结果：1．采用DispaseⅡ／Trypsin-EDTA二步法分离表皮真皮彻底，获 天津医科大学硕士学位论文（天津市科委重点攻关项目003 1 12211）取的KC纯度高、细胞的活力好。KC角蛋白19、p，整合素免疫组化染色均呈阳性，表明分离出的KC具有表皮干细胞特征，有强大的潜在增殖能力。2.中低浓度的生肌液（1:60一1:100稀释）作用于体外培养的KC和FB，MTT检测结果显著高于常规培养液组（P<0.05）;高浓度的生肌液（1:40稀释）组在培养初期0D值下降印<0.05)，培养后期与对照组无明显差异;单味药对于单细胞只在某个时期发挥作用。3.细胞与载药载体复合后，中低浓度组MTT检测结果高于常规培养液组（P<0.05）;高浓度组在培养初期0D值下降（P<0.05），培养后期与对照组无明显差异;组织学与扫描电镜结果显示细胞与载体的生物相容性良好，细胞与材料紧密粘附。4.创面修复实验结果显示:载药支架组创面收缩快于对照组;细胞+生肌膏组上皮形成较早;载药支架组形成接近成熟的上皮组织及幼稚的真皮组织;新生上皮组织中各层细胞排列规则，符合正常表皮的结构特征。 结论:1.采用DisPasell/TryPsin一EDTA二步法可获得具有强大的潜在增殖能力、高纯度的KC。2.生肌液不但是一种具有高效免疫活性的皮肤细胞诱导物，而且对细胞的增殖作用具有一定量效和时效关系，复方药中各种组分相互协同、拮抗、调节而形成一个相对稳定的促增殖环境。3.载有生肌液的明胶一壳聚糖基质材料除具有一定三维结构，使细胞能够在其表面和孔隙中生长，符合组织工程对于细胞支架材料的要求外，且有效促进KC和FB的增殖功能并能够有效抑制炎性反应。4.将处于增殖最旺盛时期的种子细胞与含有诱导作用的药物一载体支架复合贴附于创面，使种子细胞在最适环境中增殖、分化，能够在最短的时间内有效扩展皮肤缺损处的覆盖面积，尽量缩短创面愈合时间，新生的鳞状上皮组织符合正常表皮的结构特征，从而达到快速、完全修复皮肤缺损的目的。