肺癌是目前全球发病率最高的恶性肿瘤之一,其死亡率在我国恶性肿瘤死亡率中占第一位,严重威胁人们的生命健康。除了手术、放疗及传统化疗药物之外,更多研究开始关注于分子靶向药物的开发,但由于这些药物疗效的不稳定性,般仅作为肺癌治疗的二线药物。随着分子生物学研究的发展,siRNA干扰技术等基因治疗技术越来越成为研究的热点。PLK1是丝氨酸/苏氨酸激酶家族中的一员,与有丝分裂过程中纺锤体的形成及染色体的分离等有密切的关系,大量研究发现它的高表达与肿瘤的发生、发展及预后等有显著的相关性。因此利用siRNA技术调节PLK1基因在肺癌组织内的表达量,会对非小细胞肺癌有一定的治疗价值。研究已证明,利用Lipofectamine2000转染靶向PLK1基因的特异性siRNA,可降低PLK1基因的表达,从而抑制多种人类肿瘤细胞株的增殖并促进细胞凋亡,提示同样方法抑制人肺腺癌细胞株A549的可能性。另外,为了保证siRNA抑制效果的特异性,靶向基因序列的选择极为重要,单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)等基因突变的存在可能会影响到siRNA与靶向基因的特异性结合。而PLK家族的PLK3基因已被发现存在有SNP,因此推断同样是plk家族的PLK1基因存在有相似基因突变的可能性。所以,在设计PLK1特异性siRNA之前,我们先对PLK1基因开放阅读框区域(Open reading frame)的多态性进行了研究。另外,由于siRNA的转染效率受到转染时间及转染浓度等的影响,因此在研究siRNA的干扰效果之前,我们先通过预实验选择了最佳siRNA转染浓度及最佳转染后检测时间。本实验研究小细胞肺癌细胞株(NCI-H446)、非小细胞肺癌细胞株(A549、SK-MES-1)、永生化人支气管上皮细胞株(BEAS-2B)及肺癌手术标本中PLK1基因ORF区域多态性。并优化设计针对PLK1基因的siRNA,经Lipofectamine 2000包装转染,探索最安全有效的siRNA作用时间和剂量,并观察其对人肺腺癌A549细胞PLK1 mRNA和蛋白表达的影响,及对细胞增殖及生存活力的影响,为PLK1特异性siRNA治疗肺癌的可能性提供实验依据。第一部分：在小细胞肺癌、非小细胞肺癌、正常支气管上皮细胞株及30例肺癌标本中采用基因测序的方法筛查出可能存在的PLK1基因ORF区域的多态性。第二部分：避开突变片段,针对肺癌PLK1 mRNA的保守序列设计特异性siRNA,采用Lipofectamine 2000包装转染细胞,并优化转染浓度、时间等转染条件；设计未处理的A549作为空白对照,单纯PLK1 siRNA、单纯Lipofectamine 2000、错义序列组(阴性对照)、GAPDH siRNA(阳性对照)为实验对照组,与转染PLK1特异性siRNA的A549细胞作比较,用Real-Time PCR及Western-blot的方法分别观察导入前后PLK1 mRNA和蛋白表达的影响,MTT法及流式细胞分析技术分别观察细胞增殖和凋亡能力的改变。统计分析：实验所得数据运用SPSS 11.0软件统计处理,均数间两两比较采用one way-ANOVA检验。以p<0.05为显著性差异；单样本与群体样本之间的差异性用单样本t检验,以双尾检测概率P值<0.05为显著性差异。A549、NCI-H446、SK-MES-1及BEAS-2B细胞株PLK1基因的ORF区域无多态性,但前三者PLK1基因的表达量明显高于BEAS-2B,提示肺癌细胞株PLK1基因表达量的异常并非plkl自身基因突变所致,其表达水平在肺癌细胞株内可能与转录或转录后异常调节有关。30例肺癌患者组织标本中检测到一例患者PLK1基因的ORF区域有SNP(为1114位点鸟嘌呤向腺嘌呤的突变),该例突变属于杂合SNP,目前尚无法确定其对plk1表达水平、基因功能及其对肿瘤发生发展的影响,有待进一步的研究明确。选择PLK1基因的606到627位点作为靶向基因片段设计siRNA, MTT法比较转染不同浓度及不同时间后A549细胞活力的改变,根据细胞活力受抑制率确定120nnM及72h为最佳siRNA转染浓度及转染后最佳检测时间。Real-Time PCR及Western-blot结果发现PLK1 siRNA转染A549细胞后能明显抑制PLK1基因的表达(p<0.05),但其对蛋白表达的抑制率(62.0%)低于对mRNA表达的抑制率(95.93%)。MTT法及流式细胞分析技术结果显示PLK1 siRNA能明显抑制A549细胞增殖(抑制率达70.72%),促进细胞死亡(死亡率14.94%)；这一结果验证了既往的研究结果,表明PLK1在A549细胞增殖和死亡过程中起了非常关键的作用,它的异常表达是A549细胞较正常支气管上皮细胞增殖活跃的主要原因之一1三种肺癌细胞株PLK1基因的表达明显高于正常支气管上皮细胞株,但这四种细胞株PLK1基因ORF区域均无基因多态性的存在；2 30例肺癌组织标本中仅一例检测到SNP,初步提示肺癌plkl基因ORF区域具有较高的保守性；该突变存在于1114位点,属于杂合突变,并未影响到PLK1基因表达的异常；3本实验设计的靶向PLK1的siRNA能明显降低PLK1基因的表达,抑制A549细胞增殖活力、促进细胞死亡,这对PLK1 siRNA治疗肺癌的体内研究有一定的指导意义。