碳水化合物结合模块（CBM）拥有独立的折叠构象,促进酶与底物结合,但不具备催化活性。结构比对发现:来自海栖热袍菌Xyl10A的CBM9＿2（C2）与黑曲霉木聚糖酶Xyn III（X）相似度很高,但缺乏必要的结构元件—Thumb结构。Thumb是GH11家族木聚糖酶特有的结构,序列保守性高,长度为11aa,对酶与底物的结合和水解有重要作用。本研究期望,在类活性中心突变（D169E、D177E）的基础上,于K136、T137之间引入X的Thumb（N118-F128）,将结构模块C2改造成热稳定的、高催化活性的木聚糖酶。又考虑来源于中温酶的Thumb对于耐高温的C2而言可能“刚性”不足,进而依据高温酶的Thumb序列进行定点突变（E119Q、T123E、S126T）,期望进一步提高突变体的稳定性。结果如下:（1）重组质粒的构建:使用反向PCR方法。以p ET20b-C2为模板,类活性中心突变得到:p ET20b-C7（D177E,实验室前期构建）、p ET20b-C9（D169E）、p ET20b-C79（D169E/D177E）。分别插入Thumb得到:p ET20b-CT、p ET20b-C7T、p ET20b-C9T、p ET21a-C79T。Thumb定点突变得到:p ET21a-C7T-9、p ET21a-C7T-3、p ET21a-C7T-6、p ET21a-C7T-93、p ET21a-C7T-96、p ET21a-C7T-36、p ET21a-C7T-936,共14个重组质粒。（2）浓缩后测纯蛋白活性:C2等15个粗蛋白均无活性,经Ni²⁺层析纯化后超滤浓缩100倍,测到突变体C7T对山毛榉木聚糖的降解活性。（3）最适p H(p H_opt):C7T的p H_opt为4.2,较野生型X(p H_opt 3.8)提高了0.4个单位。p H3.6-4.8范围内,相对残余酶活仍保留60%以上。（4）最适温度(T_opt):C7T的T_opt为48℃,较野生型X(T_opt 46℃)提高了2℃。40℃相对残余酶活62%,51℃相对残余酶活69%。（5）半失活时间(t_1/2):C7T在50℃下的t_1/2为11.0 min,较野生型X(t_1/219.8 min)缩短了8.8 min。（6）酶促动力学参数:1)K_m值:1.2 mg·m L^-1,低于野生型X(Km值为3.6 mg·m L^-1),C7T与底物的亲和力较野生型提高3倍。2)K_cat值:1.4s^-1,较野生型X(K_cat值为600 s^-1)下降,C7T的催化活力较低。综上,本文通过类活性中心定点突变和引入Thumb结构,成功将结构域C2改造成有催化活性的木聚糖酶,且与野生型X相比,底物亲和力提高3倍,最适反应温度提高2℃。这种基于结构分析进行理性设计的改造策略,为酶分子改造提供了全新的科研思路。