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随着转基因产业的迅猛发展,转基因安全性问题逐渐成为公众关注的焦点。为此,相关国家和地区采取转基因标识制度,加强对其监管的力度。目前,转基因生物品系繁多、数量巨大,经深加工后其成分又遭到一定程度的破坏,不仅增加了检测的工作量,也增加了检测的难度。就现有的检测手段,早已无法满足目前多品系、高通量、高特异、高灵敏的快速检测需求。本研究将靶序列富集多重-聚合酶链反应和流式荧光杂交检测系统有机结合起来,建立一种在单个反应体系中同时检测五种转基因大豆的方法,实现包括转基因大豆GTS40-3-2、MON89788、A2704-12、CV127和305423的高通量、高特异和高灵敏的快速检测。研究内容如下:首先,在Genbank上检索五种转基因大豆外源基因序列和内源基因Lectin序列,通过i Cubate2.0在线软件计算外源基因连接区域序列的多聚酶亲和指数值(PPI)曲线,并利用Primer Primer5.0、Beacon Designer等软件设计12对特异性内外引物(Fi/Ri和Fo/Ro)、一对通用超级引物(Fs/Rs)和六条特异性捕获探针,其中内外引物3′端均位于高PPI值区域内,再通过调整引物长度改变Tm值,而内引物(Fi/Ri)的5′端分别添加一段能够被Fs/Rs所识别的通用序列。其次,建立五种转基因大豆的Tem-PCR反应体系。低浓度的Fo/Ro和Fi/Ri只对靶序列进行富集和加标签,高浓度的Fs/Rs对所有靶序列进行指数扩增,克服了常规多重PCR的高背景、扩增效率不一致等难题。最后,建立六种靶序列的流式荧光杂交检测体系。Rs的5′端标记生物素,其Tem-PCR产物均含有生物素标签,与微球探针进行杂交后,可与荧光报告分子(链亲和霉素-藻红素)结合产生荧光信号值,经Bio-PlexTM 200系统读取分析,可判断被检测体系中是否含有转基因成分。本研究针对五种转基因大豆成功建立了基于靶序列富集多重-聚合酶链反应的流式荧光杂交检测系统,实现了五种转基因大豆品系的高通量、高特异、高灵敏(检测限可达0.01%)检测,重复性好,五小时内即可完成整个检测过程,提高了检测效率。目前,在国内外将该联用技术用于转基因检测鲜有报道。本研究是将该联用技术用于转基因检测的一种探索,初步建立了五种转基因大豆的高通量、高特异、高灵敏的快速检测方法,也为其它转基因作物的检测研究提供理论借鉴与指导。