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不同泌乳时期水(奶)牛外周血白细胞牛全基因组表达谱芯片的数据分析表明,牛泌乳前期到中期、中期到后期有多个基因的表达量呈现2倍的上调或下调,其中ISG15和IL8均呈现泌乳前期到中期的表达下降,然后中期到后期的表达上升这样一种趋势。鉴于ISG15和IL8在先天性免疫和获得性免疫中的重要作用,我们将ISG15和IL8基因作为牛疾病抗性的重要候选基因,利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术克隆温州水牛1SG15和IL8基因全长序列,分别设计覆盖牛ISG15和IL8基因的聚合酶链式反应-单链构象多态(Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism, PCR-SSCP)引物,对比了中国荷斯坦牛、温岭高峰牛、天台黄牛、鲁西黄牛和温州水牛1L8基因的单核苷酸多态性,中国荷斯坦牛、鲁西黄牛和温州水牛ISG15基因的单核苷酸多态性,并进行了这些单核苷酸多态性与泌乳性状的关联分析,为提高牛抗病性能和改善泌乳性能提供理论基础。1温州水牛1SG15基因克隆及其生物信息学分析利用RACE技术获得了温州水牛ISG15基因的全长序列。该基因mRNA全长629bp,其中5’UTR长度为72bp (1～72bp);开放阅读框465bp (73～535bp),编码154个氨基酸；3’UTR92bp (536～629bp). ISG15基因的DNA全长包括两个外显子(1458-1460bp和1897-2424bp)和一个内含子(1461-1896bp),基因结构与其它哺乳动物ISG15基因结构一致。推定的温州水牛ISG15蛋白分子量为17333.1Da。温州水牛ISG15蛋白与水牛(AAZ38149.1)同源性最高,为99%。ISG15蛋白亚细胞定位预测结果显示,温州水牛ISG15蛋白具有信号肽的几率为13.8%。2温州水牛IL8基因克隆及其生物信息学分析利用RACE技术获得了温州水牛IL8基因的全长序列1522bp。该基因mRNA5’UTR长度为82bp(1-82bp)；开放阅读框306bp (83～388bp),编码101个氨基酸；3’UTR1134bp (389～1522bp)。ISG15基因的DNA全长序列包括4个外显子(74～137bp、1690～1839bp、2113～2196bp和2639～2660bp)和3个内含子(138～1689bp、1840～2112bp和2197～2638bp),基因结构与其它哺乳动物IL8基因结构一致。推定的温州水牛IL8蛋白分子量为11305.4Da。温州水牛IL8蛋白与水牛(AAW67481.1)和牛(ACI23534.1)同源性最高,为100%。生物信息学分析结果显示,温州水牛IL8蛋白的第31至92位氨基酸残基处存在SCY功能域(Intercrine alpha family, chemokine CXC)。3牛ISG15基因PCR-SSCP检测及其多态性分析182头中国荷斯坦奶牛尾静脉血采自于浙江省金华市伊康乳业奶牛场。温州水牛尾静脉血采自浙江省温州市平阳县挺志温州水牛乳业有限公司(32头)和湖北省荆门市沙洋县五里镇奶水牛养殖示范基地(102头)。19头温岭高峰牛静脉血采自温岭畜牧兽医站。22头天台黄牛静脉血采自天台畜牧兽医站。血液均经过EDTA Na2抗凝,以进行后续的外周血白细胞总RNA和DNA的提取。鲁西黄牛基因组DNA样品(55个个体)由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所李俊雅研究员提供。使用了15对引物对中国荷斯坦牛、鲁西黄牛和温州水牛ISG15基因进行了PCR-SSCP检测。中国荷斯坦牛群体内发现了g.2241G→A的突变,并且该突变属于中度多态性(0.25<PIC<0.5)。温州水牛群体内则存在g.374G→A、g.433C→T、g.1806G→C和g.2104G→A这4个突变,其中g.374G→A和g.2104G→A属于低度多态性(PIC<.25), g.433C→T和g.1806G→C属于中度多态性(0.25<PIC<0.5)。Χ2适合性检验结果表明,温州水牛群体中g.433C→T和g.1806G→C偏离了Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)。鲁西黄牛群体内未筛选到突变。中国荷斯坦牛和温州水牛筛选到的突变位点与乳质性状的关联分析结果表明,g.2241G→A可显著影响中国荷斯坦牛的乳蛋白率(P<0.05),极其显著影响中国荷斯坦牛的体细胞评分。温州水牛群体内的突变位点与其乳质性状关联分析结果没有发现有显著影响的关联位点。4牛IL8基因PCR-SSCP检测及其多态性分析使用了17对引物对中国荷斯坦牛、温岭高峰牛、天台黄牛、鲁西黄牛和温州水牛IL8基因进行了PCR-SSCP检测。中国荷斯坦牛、温岭高峰牛、天台黄牛、鲁西黄牛群体内发现了g.-63G→A、g.249C→T、g.311C→T、g.349A→G、g.1247C→T、 g.1501G→T、g.1939A→C、g.1986G→A、g.2256T→G、g,2269G→A、g.2420G→A、 g.2831A→G、g.2904T→C和g.3-0G→A突变。均属于中度多态性(0.25<PIC<0.5)。Χ2适合性检验结果表明,g.1247C→T和g.1501G→T偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)。温州水牛群体内未发现突变位点。中国荷斯坦牛IL8基因的连锁不平衡分析显示,该基因内存在4个单倍域(Haplotype block), g.249C→T、g.1939A→C、g.2256T→G和g.2831A→G为选择的htSNP。g.249C→T与g.311C→T、g.349A→G,g.1939A→C与g.1986G→A,g.2256T→G与g.2269G→A, g.2831A→G与g.2904T→C、g.3030G→A之间的r2值为1,g.249C→T可代替g.311C→T和g.349A→G效应,g.1939A→C可代替g.1986G→A效应, g.2256T→G可代替g.2269G→A效应,g.2831A→G可代替g.29-T→C和g.3030G→A效应。由g.249C→T、g.1939A→C、g.2256T→G和g.2831A→G这四个htSNPs构建的单倍型即可反映整个基因的单倍型信息。中国荷斯坦牛SNPs与乳质性状的关联分析结果表明,g.-63G→A对305天产奶量有显著影响(P<0.05),各基因型乳蛋白率呈现出GG>GA>AA的趋势。g.249C→T对305天产奶量和乳脂率有显著影响(P<0.05)。g.1247C→T对体细胞评分有显著影响(P<0.05),各基因型乳脂率和体细胞评分呈现出CC<CT<TT的趋势。g.1501G→T对305天产奶量有显著影响(P<0.05),各基因型305天产奶量呈现出GG<DT<TT的趋势。g.1939A→C对泌乳性状没有显著影响,但发现各基因型乳脂率和体细胞评分呈现出AA<AB<BB的趋势。g.2256T→G对乳脂率有显著影响(P<0.05),各基因型乳脂率、乳蛋白率和体细胞评分呈现出AA<AB<BB的趋势。g.2240G→A对泌乳性状没有显著影响,但发现各基因型乳蛋白率呈现出GG<GA<AA的趋势。g.2831A→G对305天产奶量有极显著影响(P<0.01),对乳脂率有显著影响(P<0.05),各基因型乳脂率和体细胞评分呈现出AA<AB<BB的趋势,乳蛋白率呈现出AA>AB>BB的趋势。