艾滋病(AIDS)主要是由人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染引起的严重危害人类健康的重大传染病之一。将针对病毒生命周期不同阶段的三种及以上抗病毒药物联合应用的“高效抗逆转录病毒疗法”(HAART)的应用大大降低了艾滋病的发病率和死亡率,然而,由于不能将艾滋病毒彻底从患者体内清除,患者需要长期甚至终生服药,这就带来了严重的毒副作用和耐药性等一系列问题,迫使人们不断研发新型的抗艾滋病药物来拓展其临床治疗方案。逆转录酶(Reversetranscriptase,RT)将病毒RNA逆转录为双链DNA,在HIV-1的复制周期中发挥着不可或缺的重要作用,目前已经成为抗艾滋病药物研发的优选靶点之一。根据其结构功能的不同,RT可以分为聚合酶结构域和RNase H结构域两个部分。目前经美国FDA批准上市的逆转录酶抑制剂均作用于聚合酶活性位点,可分为核苷/核苷酸类逆转录酶抑制剂(Nucleos(t)ide reverse transcriptase inhibitors,N(t)RTIs)和非核苷类逆转录酶抑制剂(Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors,NNRTIs)两类,其中 NNRTIs 凭借其高活低毒、选择性强等优点成为HAART的重要组成部分。但随着NNRTIs的广泛应用,临床治疗中出现的严重毒副作用、日益猖獗的耐药毒株以及药代动力学性质不佳等问题使其疗效大打折扣。因此,亟需研发作用于新结合位点或具有新结构类型的具有更高基因屏障和更佳药代动力学性质的高效低毒HIV-1 NNRTIs。作为RT的另一重要结构域,RNaseH选择性降解RNA/DNA杂合链中的RNA链,在HIV-1逆转录过程中发挥着关键作用,是非常有前景的药物设计新靶标。尽管目前已经有大量文献报道了结构多样的RNaseH抑制剂,但大多数存在靶点活性较低、细胞水平抗病毒活性差且毒性较大等缺点,致使目前该类抑制剂均止步于临床前研究阶段,因此迫切需要开发具有高特异性、高细胞活性及高安全性的新型HIV-1 RNase H抑制剂。RNase H作为金属蛋白,使得对于RNase H抑制剂的分子模拟研究存在局限性,这为基于靶点结构的合理药物设计带来了很大的挑战。而与RNase H同属于核苷酸转移酶超家族、活性中心结构极为相似的HIV-1整合酶目前已有4个催化活性位点抑制剂经美国FDA批准用于HIV-1的治疗。整合酶(IN)和RNase H的家族同源性、结构相似性、功能连续性以及双二价金属离子介导的酶催化机制为研发IN/RNase H双靶点抑制剂提供了启示。新型含羟基的氮杂环类HIV-1整合酶/RNase H双靶点抑制剂的设计、合成与活性评价。目前临床上最常用的以多种药物联合应用为特征的高效抗逆转录疗法在一定程度上能够显著降低艾滋病患者体内的HIV-1病毒载量,减缓病程发展,但多重药物疗法用药量极大,毒副作用严重且药物相互作用复杂,病人的依从性差。因此,多靶点HIV-1抑制剂已成为目前抗艾滋病药物研发的新热点。优势结构是指多种受体的配体分子中的共有结构或者可以衍生出对多种受体均具有高亲和活性的配体的分子骨架,一般具有类药性好、设计灵活性高、合成简便易得等特点,备受药物化学家的青睐。基于以上分析,我们对于新型HIV-1整合酶/RNase H双靶点抑制剂的设计应综合考虑配体的优势结构和药物靶点的需求,一方面,靶标与配体的结合模式以及现有抑制剂的药效团特征为新型抑制剂的设计提供了理论基础;另一方面,基于优势结构与基于靶标的药物设计相辅相成。本章在靶标结构与现有药效团模型的基础上,发挥优势结构的中导向作用,在分子杂合、骨架跃迁等药化策略的指导下,设计并合成了羟基喹哇啉类和吡啶骈嘧啶酮类两大系列新型HIV-1整合酶/RNase H双靶点抑制剂并对其进行了酶活及细胞水平的抗病毒活性测试。活性结果表明,羟基喹唑啉类化合物ⅡA-6A～6B系列均为有效的HIV-1 RNase H抑制剂,IC50值在0.41～20.1 μM之间。其中化合物HA-6B-4活性最高,IC50值为 0.41 μM,是阳性对照β-thujaplicinol(IC50=1.98μμM)的 5 倍,同时该化合物也表现出优异的HIV-1整合酶链转移抑制活性,其IC50为0.85 μM,低于阳性对照Raltegravir(IC50=71 nM)。尽管该类目标化合物对HIV-1 RNase H和HIV-1 IN链转移活性表现出较强的抑制作用,但遗憾的是,它们却未能按预期表现出良好的细胞水平抗HIV活性。尽管如此,该类化合物细胞毒性极低,优于对阳性照药Raltegravir。细胞膜通透性实验结果解释了该类化合物具有较高的酶抑制活性却未在细胞水平表现预期活性的原因,提示我们在后续的修饰中在考虑化合物与靶标亲和力的同时,还应重视对化合物的理化性质及透膜性的改善,以提高发现高效抗HIV-1活性的抑制剂的几率。在吡啶骈嘧啶酮系列化合物中,除ⅡB-9-2和ⅡB-9-9外,其余Ⅱ系列化合物均为有效的HIV-1 RNase H抑制剂,IC50值在0.50～4.92 μM之间。其中化合物 ⅡB-9-3、ⅡB-9-4、ⅡB-9-5和ⅡB-9-对 HIV-1 RNase H 抑制活性均超过阳性对照β-thujaplμcμn(IC50=1.98μ]M),11B-9-4在该系列中活性最高,IC50值为0.50μM,是阳性对照β-thuj aplicinol的4倍。在8个目标化合物中,有4个化合物表现出了细胞水平的抗HIV-1活性,其中活性最佳的化合物为ⅡB-9-4,其对HIV-1的EC50值为14.69 μM,值得注意的是,该化合物同时也是HIV-1 RNase H抑制活性最高的化合物。此外,该化合物对HIV-2毒株的抑制活性(EC50值为21.00μM)与抗HIV-1活性几乎相当。由于该系列化合物极性较大且溶解性较差使得分离较为困难,因此所得目标化合物数目较少,无法全面探讨构效关系,但为进一步的结构优化奠定了基础。新型吲哚芳砚类HIV-1 NNRTIs的设计、合成与活性评价。目前上市的用于治疗-HIV-1的非核苷类逆转录酶抑制剂的耐药性问题已不容忽视,本章在吲哚芳基砜的结构基础上,将精准靶向突变后氨基酸和增强与保守氨酸作用力两种策略应用于解决突变导致的耐药性问题当中。首先,在课题组前期工作的基础上,评价了通过引入共价基团特异性靶向Y181C突变残基ⅢA系列的抗HIV-1活性,其中化合物ⅢA-7在酶水平测试中对Y181C IC50为18.2μM,较未引入共价基团的阳性对照(IC50=75.2μM)有大幅度提高,同时对该化合物进行了逆转录酶复合物MALDI-TOF质谱分析,证实其作用模式确实为共价型Y181C抑制剂。随后在吲哚芳基砜的结构基础上设计合成了一系列靶向保守氨基酸W229的非共价型化合物,虽然该类化合物活性结果不尽如人意,但引入含π体系的苄基的部分化合物在细胞活性测试中对HIV-1 Y181C的抑制活性相比野生型未见明显下降,而适当的取代基引入使对化合物的抗Y181C型HIV-1活性大幅度提高,甚至部分衍生物对Y181C型HIV-1的活性反超野生型活性,这一定程度上证实了我们通过引入基团增加化合物与保守氨基酸的相互作用来抵抗Y181C耐药的设计理念的合理性。活性最好的化合物为ⅢB-7R-10,其对野生型HIV-1活性EC50为1.25 μM,是阳性对照拉米夫定的2.6倍,值得注意的是该化合物对Y181位突变的耐药株Y181C的抑制活性EC50为0.67 μM,约为其野生株抑制活性的两倍,是拉米夫定的3.7倍,奈韦拉平的11倍。以上活性结果表明,通过共价结合精准靶向突变后的半胱氨酸和增强与保守氨酸W229作用力两种策略均可提高化合物对Y181C耐药株的抑制活性与选择性。但在此基础上我们也应该注意到保持化合物原有作用力才能发现对野生株和耐药株均具有良好活性的先导化合物。新型二芳基嘧啶类HIV-1 NNRTIs的设计、合成与活性评价。本章主要针对目前临床上使用的最新一代NNRTIs药物已出现的严重耐药性问题,在DAPYs经典的“四点药效团”模型指导下,进行了如下探索:1)运用构象限制策略,在上市药物依曲韦林的结构基础上,保留其右侧活性必须的NH Linker而选择在左侧并环,并在并环后体系中引入富含氢键供受体的侧链取代基,试图通过并环锁定DAPY的优势构象并使所引入侧链指向可容纳区域Ⅱ,以期通过与附近氨基酸和溶剂界面形成广泛作用力而提高化合物的活性和抗耐药性;2)受稠合中心环类抑制剂的启发运用骨架跃迁及电子等排策略,将稠合环拆分为由可旋转单键相连的双环类化合物,在可容纳区域Ⅱ引入各种杂环、不同体积大小和电荷特征的末端取代基,对化学环境和周围氨基酸残基特点进行探索。IVA系列大部分化合物均表现出优秀的抗病毒潜力,部分化合物对突变株也展示出了突出的抑制活性,对E138K单突变株的EC50均在亚微摩尔到纳摩尔级别之间,远超阳性对照拉米夫定和奈韦拉平,与齐多夫定和依曲韦林相当。如化合物 IVA-7D(EC50-ⅢB=0.07 μM,EC50-E138K=0.01 μM),其对 E138K 抑制活性达到了野生株的 7 倍,此外化合物 IVA-8V(EC50-ⅢB=0.03 μM,EC50-E138K=0.03μM)和IVA-8Q(EC50-ⅢB=0.03μM,EC50-E138K=0.09 μM)均表现不俗,是新颖的E138K选择性抑制剂;同时该部分化合物对L100I、K103N、Y181C和Y188L也具有微摩尔级抑制活性,值得进一步研究。系列IVB化合物均为高效的野生型HIV-1抑制剂,其抑制活性在纳摩尔与亚微摩尔之间,其中IVB-5-4与IVB-5-8活性最佳,EC50值均为2.5 nM,远超阳性对照NVP,并与ETV和EFV处于同一数量级,同时对多种HIV-1临床常见单突变株如L100I、K103N、Y181C、Y188L、E138K等保持了纳摩尔级抑制活性,显著优于上市药物NVP并与EFV、ETR基本相当,均有作为先导物进一步优化的价值。基于CuAAC点击化学和原位筛选技术的抗HIV-1活性先导化合物的发现。优质化合物库的构建与高效筛选一直是先导化合物发现的关键环节。CuAAC点击化学具有操作简单、条件温和、对水和氧不敏感、收率高、选择性好、后处理简单等优点,开创了快速、有效、选择性地合成化合物的新领域。针对逆转录酶可容纳区域Ⅱ柔性较大、可容纳性较高的特点,本章首次将基于CuAAC点击化学的优势片段组合库构建及快速筛选技术运用于以吲哚芳基砜骨架靶向可容纳区域Ⅱ的HIV-1先导化合物的发现中。通过微量建库方法合成得到78个含三氮唑基团的吲哚芳基砜类NNRTIs,经抑酶活性快速筛选得到苗头化合物,并经毫克级制备及细胞水平(MT-4)的抗病毒活性测试。所测试化合物均强烈抑制HIV-1 MB野生株复制,EC50值为0.024-0.23μM,远优于阳性药物拉米夫定(EC50=5.02 μM),除C1N5和C1N15外,其余11个化合物活性均超过了第一代上市药物NVP(EC50=0.16 μM)。其中化合物C1N4(EC50=0.024 HM)的抗HIV-1 ⅢB活性最好且细胞毒性极低(CC50>215.88μM)。部分化合物也显著抑制Y188L、E138K等HIV-1单突变株的复制,具有进一步研发的价值。综上,本论文针对目前上市药物耐药性问题严重的科学问题,基于HIV-1复制周期关键作用酶(逆转录酶及整合酶)的晶体结构分析,从优化现有靶标抑制剂和开发新靶标抑制剂两方面入手,综合运用电子等排、骨架跃迁、构象限制、多靶点多位点结合等药物设计策略和基于配体、基于靶点的药物设计方法,设计并合成了新型羟基喹唑啉类、吡啶骈嘧啶酮类HIV-1 RNase H与整合酶双靶点抑制剂及吲哚芳基砜类和二芳基嘧啶类HIV-1 RT抑制剂共7系列化合物,最终通过定向合成得到一百三十余个化合物。经细胞水平和酶水平活性测试测试,发现了多个化合物具有较高活性的先导化合物,化合物IVA-6D、IVA-7D、IVA-8V、IVB-5-4、IVB-5-8等对野生株及部分临床常见突变株抑制活性均达到纳摩尔级,显著超过第一代上市药物NVP,与第二代药物ETV处于同一数量级。令人惊喜的是,其中化合物IVA-6D、IVA-7D、IVA-8V对目前临床上第二代NNRTIs耐药最为严重的E138K毒株表现出乎意料的选择性,可作为先导化合物进一步研究。