目的：　　 研究证明:Frat(frequently rearranged in advanced T-cell lymphomas)是Wnt信号传导途径的正向调节因子,通过与糖原合成酶激酶3(GSK3)结合,抑制GSK3依赖的磷酸化作用,从而使β-catenin水平升高,β-catenin通过与TCF4结合而激活靶基因。目前,已有研究报道FRAT1在一些恶性肿瘤中有过表达,但是其过表达是否与肿瘤的临床病理因素有关尚不清楚,在肿瘤组织中Frat1过表达与β-catenin表达的关系是否与细胞系当中所获得的结果一致也未见报道。因此我们选择了137例肺癌手术患者的标本(其中78例有随访资料,59例有淋巴结转移灶标本)对Frat1的表达与β-catenin、TCF4表达的关系进行探讨,以明确在肺癌组织中的表达情况和与临床病理因素之间可能的关系。　　 材料与方法：　　 1、材料　　 137例原发性肺癌患者的术后组织标本收集自中国医科大学附属第一医院病理科1998-2005年存档蜡块。男性89例,女性48例,男女性别比1.8:1。年龄33～76岁(中位年龄58岁)。按UICC(2002)肿瘤TNM分期标准:Ⅰ期34例,Ⅱ期37例,Ⅲ期61例,Ⅳ期5例。按WHO(2004)肺癌分类标准,鳞状细胞癌63例,腺癌74例。高分化30例,中分化74例,低分化33例。对其中59例肺癌患者的原发灶及淋巴结转移灶组织标本对比分析。对其中78例进行了术后随访,随访日期计算从手术日起,到因复发/转移而死亡或随访截止日期为止,截止日期为2007年8月25日。所有病例术前均未接受放、化疗。　　 2、免疫组织化学染色　　 组织经中性福尔马林固定、石蜡包埋,制成4um连续切片。切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后行LSAB法免疫组化染色。一抗为羊抗鼠Frat1多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA1:50)、鼠抗人β-catenin单克隆抗体(即用型,购自福州迈新生物技术公司)和鼠抗人TCF4多克隆抗体(SantaCruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA1:100)。生物素标记的二抗(MB-9207,Maixin Biotechnology,Fuzhou,China)为即用型。3,3’-二氨基联苯胺(DAB)进行显色。以磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Saline,PBS)代替一抗作为阴性对照。SP超敏免疫组织化学试剂盒和DAB酶底物显色试剂盒购自福州迈新生物技术公司。　　 3、结果判定　　 选肿瘤细胞阳性染色集中区域,每张切片计数400个癌细胞,由两名病理医师双盲观测。Frat1评分标准:在正常的肺泡上皮及支气管上皮为阴性表达,阳性细胞≤10％为阴性表达;≥11％为阳性表达。β-catenin评分标准参考Xu等标准.正常上皮组织中阳性表达并定位于细胞膜,阳性细胞数＞90％。阳性瘤细胞数≤90％为表达降低,10％以上瘤细胞核/浆表达为异位表达,异位表达和表达降低统归为异常表达。TCF4判定标准与Frat1评分标准相同。　　 4、细胞培养　　 人类肺癌细胞系A549、LTE、661、460、BE1培养于含10％灭活胎牛血清、2.3g/LNaHCO3、100units/ml青链霉素的RPMI1640(Invitrogen,美国)培养液中,贴壁生长,每2天用0.25％胰酶(Invitrogen)消化传代。　　 5、Transwell　　 用无血清的RPMI1640培养液将细胞浓度调整至5×106个/ml,取100μL细胞悬液滴入上室内(5×105个细胞),下室加入含有10％胎牛血清的RPMI1640培养液,上下室之间用孔径为8μm的聚碳酸酯微孔滤膜(Corning,美国)分开,将小室置37℃,5％CO2条件下分别放置6,12,18h后,弃去上室内液体,擦尽膜上Matrigel胶,100％甲醇固定30分钟,常规苏木素染色,光镜下计数细胞数。　　 6、统计学分析　　 应用SPSS for Windows14.0统计分析软件进行数据处理。免疫组化结果采用x2检验,Spearman等级相关分析,Kaplan-Meier法,Log-Rank检验。细胞系实验结果采用t检验,P＜0.05具有统计学意义。　　 结果：　　 1、Frat1在肺癌组织中的表达及其与临床病理因素的关系　　 Frat1在正常的肺泡上皮及支气管上皮为阴性表达。Frat1在肺癌组织中的阳性信号主要表达在细胞浆,为弥漫分布,偶见胞核/胞浆阳性。阳性表达率为62.0％(85/137)。中分化(25/36,73.5％)、低分化(23/27,85.2％)肺癌中Frat1的表达高于高分化(4/17,23.5％)的病例(P=0.035)。　　 有淋巴结转移的病例Frat1异常过表达率为68.0％(66/97)高于没有淋巴结转移病例的47.5％(19/40)的病例(p=0.024)。Ⅰ期、Ⅱ期患者的阳性率为50.7％(35/69)明显低于Ⅲ期、Ⅳ期患者的阳性率73.5％(50/68)(P=0.006)。　　 在配对资料中,Frat1在转移灶中的异常过表达率为83％(49/59)明显高于原发灶的异常表达率64.4％(38/59)(P=0.015)。　　 在78例有随访资料的术后患者当中,生存时间为3-112个月,平均生存时间为46.90±3.70个月,中位生存时间为37.72±5.24个月。我们用Kaplan-Meier法(Log Rarlk检验)对78例NSCLC患者术后生存期进行了分析,结果显示,Frat1阳性表达患者术后生存时间明显小于正常表达者(p=0.037)。　　 2、Frat1过表达与β-Catenin和TCF4的异常表达正相关　　 β-Catenin在正常的支气管上皮为膜阳性表达,在肺癌组织中表现为膜表达减弱、胞浆或胞核中出现异常表达。β-Catenin的异常表达率为68.6％(94/137)。中、低分化肺癌中β-Catenin的异常表达高于高分化的病例(分别为高分化43.3％、中分化73.0％、低分化81.8％,P=0.002)。有淋巴结转移的病例β-Catenin异常表达(72/97)高于没有淋巴结转移(22/40)的病例(p=0.027)。在配对资料中β-Catenin在转移灶中的异常表达(53/59)高于原发灶的异常表达(43/59)(P=0.041)。β-Catenin在Ⅲ期、Ⅳ期患者的表达(53/68)高于Ⅰ期、Ⅱ期患者的表达(41/69)(P=0.020)。用Kaplan-Meier法(Log Rank检验)对78例NSCLC患者术后生存期进行了分析。β-Catenin表达异常的患者的生存时间明显小于正常表达的患者(P=0.012)。　　 TCF4在正常的支气管上皮为阴性表达,在肺癌组织中阳性信号主要表达在细胞浆,为弥漫分布,偶见胞核/胞浆阳性。TCF4的异常表达率为70.1％。中、低分化肺癌中TCF4的表达高于高分化的病例(分别为高分化33.3％、中分化77.0％、低分化75.8％,P=0.007)。有淋巴结转移的病例TCF4异常表达(73/97)高于没有淋巴结转移(23/40)的病例(p=0.039)。在配对资料中TCF4在转移灶中的异常表达(54/59)高于原发灶的异常表达(43/59)(P=0.019)。TCF4在Ⅲ期、Ⅳ期患者的表达(55/68)高于Ⅰ期、Ⅱ期患者的表达(41/69)(P=0.006)。用Kaplan-Meier法(Log Rank检验)对78例NSCLC患者术后生存期进行了分析。TCF4表达异常的患者的生存时间明显小于正常表达的患者(P=0.033)。　　 在137例肺癌原发灶中Frat1过表达与β-catenin的异常表达呈正相关(p=0.003)TCF4的异常表达与Frat1的过表达同时呈正相关(p=0.037)。　　 3外源性的Frat1抗体可以降低Frat1高表达的肺癌细胞系中β-Catenin和TCF4的表达水平,下调其侵袭能力。　　 结论：　　 1、Frat1在肺癌组织中呈高表达,并与肺癌的分化程度正相关,其低表达者预后明显好于高表达者。　　 2、Frat1表达与β-Catenin和TCF4的异常表达正相关,可能是Wnt信号通路中促进β-Catenin异常累积并导致下游靶基因激活的重要环节。　　 3、外源性的Frat1抗体可以降低Frat1高表达的肺癌细胞系中β-Catenin和TCF4的表达水平,下调其侵袭能力。