旋毛虫病是一种因食用含有旋毛虫幼虫囊包的未煮熟的或生的肉类（通常是猪肉）引起的寄生虫病。它可引起的症状,从全身性发热,恶心,呕吐,腹痛,腹泻,肌痛到更严重的脑炎和心肌炎。旋毛虫侵入小肠上皮细胞（intestinal epithelial cells,IECs）进一步发育是其感染宿主的关键,这一过程不只是机械性损伤,还可能与旋毛虫的一些水解蛋白酶有关。在旋毛虫感染性幼虫体外与IECs共培养后增加的蛋白中发现了一种旋毛虫氨基肽酶（Trichinella spiralis aminopeptidase,TsAP）,推测该蛋白可能与旋毛虫侵入宿主IECs有关。本研究对TsAP基因进行了克隆表达,获得了重组的TsAP（rTsAP）。应用q PCR、Western blot分析TsAP在旋毛虫不同虫期的转录、表达水平,并进行免疫荧光（IFA）分析虫体定位。通过对特异性底物─亮氨酸-对硝基苯胺（Leucine-p-nitroanilide,L-p NA）的水解测定rTsAP的酶活性。应用Western blot、ELISA和IFA技术分析rTsAP与IECs蛋白的结合作用,通过RNA干扰技术及侵入实验证明TsAP对旋毛虫侵入、发育及生殖的影响。材料与方法1.旋毛虫虫种、实验动物、细胞、质粒和菌种旋毛虫（T1）为本实验室昆明小鼠保种;实验动物为BABL/c小鼠,购于河南省实验动物中心;细胞为小肠上皮细胞（IECs）,为本实验室从正常小鼠小肠分离鉴定得到;克隆和表达菌均为BL21,克隆载体为p MD19-T,表达载体为p QE-80L。2.TsAP生物信息学分析利用NCBI在线网站预测TsAP（Gen Bank accession no:XP＿003377703.1）的结构域和酶活性位点。运用Bio Edit软件,将TsAP与其他旋毛虫属氨基肽酶进行序列比对,用MEGA7.0的邻接法构建TsAP的系统发育进化树。3.TsAP的克隆表达及抗原性分析将TsAP基因连接到克隆载体p MD19-T中,测序后,经双酶切将TsAP基因连接到p QE-80L表达载体上,构建重组表达质粒p QE-80L/TsAP。表达出重组蛋白rTsAP,过镍柱纯化后,免疫小鼠制备抗rTsAP免疫血清。将p QE-80L/TsAP/BL21未诱导全菌蛋白、诱导全菌蛋白、过柱纯化后的rTsAP进行Western blot,分析rTsAP的抗原性。4.TsAP在旋毛虫各个虫期的表达及虫体定位用Trizol提取各个虫期[肌幼虫（ML）、肠道感染性幼虫（IIL）、成虫（AW）、新生幼虫（NBL）]RNA,并反转录为c DNA,通过q PCR分析TsAP基因在不同虫期的转录。制备各个虫期虫体可溶抗原,经Western blot分析TsAP在各个虫期的表达情况。收集不同虫期新鲜虫体制成石蜡切片,进行免疫荧光分析TsAP在旋毛虫不同虫期表达及定位。5.rTsAP酶活性测定rTsAP具有催化特异性底物L-p NA水解产生p NA的能力,p NA的光吸收峰值波长为405 nm,通过测定405 nm处吸光值的变化,计算出rTsAP的酶活力。通过测定不同温度、不同p H值以及有不同金属离子和酶抑制剂存在时反应的OD₄₀₅,观察rTsAP酶反应的最佳温度、p H值,以及不同金属离子和抑制剂对酶活性的影响。6.TsAP与IECs的结合作用及其对旋毛虫幼虫侵入IECs时的作用应用Western、ELISA和IFA技术证明TsAP与IECs的结合作用。将rTsAP与肠道感染性幼虫（IIL）接种至IEC单层,同时设置BSA、抑制剂对照组,证明TsAP在旋毛虫侵入IECs时的作用。将rTsAP免疫血清与IIL接种至IEC单层,以旋毛虫感染鼠血清为阳性对照、正常鼠血清为阴性对照,观察特异性抗体封闭对IIL侵入IECs的阻断作用。7.干扰TsAP基因的表达对旋毛虫幼虫侵入IECs的影响设计TsAP特异性si RNA（si RNA-842）,通过Western blot分析si RNA-842干扰的最适浓度和最佳时间,测定干扰后的肌幼虫虫体可溶蛋白中天然的酶活性,然后将干扰后的肌幼虫经胆汁激活为肠道感染性幼虫（IIL）后进行体外侵入实验,观察TsAP基因表达沉默后对旋毛虫幼虫侵入IECs的阻断作用。8.干扰TsAP基因后幼虫攻击感染实验将60只BALB/c小鼠分成3组（每组20只）,将3μМsi RNA-842、Control si RNA或PBS干扰后的肌幼虫,按300条/只经口分别接种于20只小鼠。感染后6 d,每组剖杀10只小鼠收集肠道成虫并计数,拍照虫体测其长度。每组随机抽取30条雌虫,在24孔板中用RPMI-1640培养,72 h后对每组雌虫所产新生幼虫计数,并拍照测长度。感染后60 d,剖杀剩余小鼠,计算肌幼虫虫荷并测长度。9.统计分析将实验得到的数据用Excel 2010进行整理,运用SPSS 20.0进行统计分析,根据所用实验方法和数据类型选择相应的统计方法,包括单因素方差分析与卡方检验。检验水准为α=0.05。结果1.TsAP生物信息学分析旋毛虫氨基肽酶包含两个M17家族的结构域,属于金属蛋白酶。有8个酶活性位点,分别为264赖氨酸（Lys）、269天冬氨酸（Asp）、276赖氨酸（Lys）、287天冬氨酸（Asp）、348天冬氨酸（Asp）、350谷氨酸（Glu）、352精氨酸（Arg）、376亮氨酸（Leu）,他们紧密排布于该蛋白分子空间结构中,构成底物结合催化位点。进化树显示,旋毛虫属的11个种/基因型的单系群得到了很好的支持,与肠道寄生鞭虫关系较近。在旋毛虫属内,发现了两个不同的进化枝:一个是成囊型旋毛虫进化枝,另一个是非成囊型旋毛虫进化枝。2.TsAP的克隆表达及抗原性分析将TsAP基因连接到克隆载体p MD19-T中,测序结果表明TsAP基因与Gen Bank上TsAP的基因序列相似度为98%。双酶切后将TsAP基因连接到p QE-80L上,构建重组表达质粒p QE-80L/TsAP。加入0.8 m M IPTG,16°C诱导24 h后收集菌体进行SDS-PAGE,在分子量为55.7 k Da处出现一条蛋白带,可溶性分析表明rTsAP在上清中较多。将纯化后的rTsAP免疫小鼠制备抗rTsAP免疫血清。将p QE-80L/TsAP/BL21未诱导全菌蛋白、诱导全菌蛋白、过柱纯化后的rTsAP进行Western blot分析,结果显示,rTsAP可以被旋毛虫感染鼠血清、抗rTsAP免疫血清及His单抗识别,证明其抗原性良好。3.TsAP在旋毛虫各个虫期的表达及虫体定位qPCR结果显示,TsAP在旋毛虫不同虫期转录水平的差异有统计学意义（F=110.851,P<0.001）。肠道感染性幼虫、成虫和新生幼虫分别为肌幼虫的3.03倍（P<0.001）、1.72倍（P<0.01）、0.14倍（P<0.01）。Western blot结果显示抗rTsAP血清可识别旋毛虫不同虫期粗抗原中天然的TsAP,且不同虫期TsAP的表达量有差异（F=55.706,P<0.001）。肠道感染性幼虫、成虫TsAP蛋白表达量分别为肌幼虫的1.60倍（P<0.001）、1.71倍（P<0.001）,新生幼虫蛋白表达量为肌幼虫的1.14倍（P>0.05）。虫体切片免疫荧光试验结果表明TsAP主要定位于旋毛虫皮层和雌成虫的胚胎中。4.rTsAP酶活性测定rTsAP的酶活性随着rTsAP蛋白浓度的增加而逐渐增强,在浓度为0.032μg/μL时趋于平稳,最适反应温度为50°C,最佳p H值为8.0。Mn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺对rTsAP的酶活性均有增强作用,作用大小为Mn²⁺>Co²⁺>Ni²⁺。金属蛋白酶抑制剂1,10-Phenanthroline对rTsAP的酶活性有抑制作用,其他蛋白酶抑制剂对酶活性没有影响。rTsAP对Leu-p NA的水解作用符合米曼氏动力学,动力学参数Vmax为28.99μM·min^-1,Km为14.04 m M。5.rTsAP与IECs的结合Far-Western结果显示IECs蛋白被抗rTsAP抗体识别12条带（49.8、45.6、42.3、38.6、36.8、35.5、32.9、30.7、28.7、27.3、25.3、17.3 k Da）,被感染旋毛虫小鼠血清识别4条带（42.3、38.8、35.8、28.7 k Da）,但不能被正常鼠血清识别。证明rTsAP能够与IECs蛋白特异性结合,并可能与旋毛虫侵入鼠小肠IECs有关。ELISA结果显示rTsAP能与IECs蛋白结合,OD值与IEC蛋白包被浓度有关（r=0.878,P<0.01）,随着IECs蛋白浓度增加而升高（F=127.553,P<0.001）;OD值还与rTsAP孵育浓度有关（r=0.868,P<0.05）,随着rTsAP浓度增加而升高（F=938.272,P<0.001）。IFA与共聚焦显微镜检查结果显示,rTsAP与IECs的结合部位主要在胞浆。6.rTsAP与抗rTsAP免疫血清对旋毛虫侵入IECs的作用rTsAP浓度为12、16、20、24μg/m L时与对照组的侵入率差异均有统计学意义（P<0.01）,对旋毛虫侵入IECs的促进率分别为23.61%、28.98%、31.77%和32.48%。表明rTsAP对旋毛虫的侵入具有促进作用,且促进率与rTsAP浓度相关（r=0.916,P<0.001）,随浓度的增加而增加（F=215.761,P<0.001）。抗rTsAP免疫血清稀释度为1:100、1:200、1:400、1:800时与正常血清组的侵入率差异均有统计学意义（P<0.01）,对旋毛虫侵入IECs的抑制率分别为35.66%、27.62%、21.02%和18.61%。证明抗rTsAP免疫血清对旋毛虫侵入IECs有抑制作用,且其抑制率与抗rTsAP免疫血清剂量相关（r=0.924,P<0.001）,随抗rTsAP免疫血清稀释度的增加而降低（F=175.096,P<0.001）。7.沉默TsAP基因对旋毛虫侵入IECs的阻断作用Western blot结果显示,si RNA-842浓度为2μM、3μM、4μM时,TsAP蛋白表达量分别被抑制了44.64%、57.98%和40.71%（P<0.01）;干扰天数为1 d、3 d、5 d时,TsAP蛋白表达量分别被抑制了23.59%、43.17%和50.90%（P<0.01）。结果表明si RNA-842浓度为3μM,培养时间为5 d时干扰效果最好,且si RNA-842对TsAP干扰具有特异性。si RNA-842干扰后,与PBS组相比TsAP酶活性抑制率为49.72%（F=1246.154,P<0.001）。沉默TsAP基因对幼虫侵入IECs的抑制率为32.35%（F=921.579,P<0.001）。8.干扰TsAP基因后对旋毛虫侵入、发育及生殖力的影响siRNA-842处理组与PBS组相比,6 d成虫减虫率为39.58%（F=50.033,P<0.001）,雌虫生殖力（新生幼虫产量）明显降低（F=171.278,P<0.001）,肌幼虫减虫率为56.03%（F=180.217,P<0.001）。与PBS组相比,si RNA-842处理组雌成虫长度明显变短（F=43.018,P<0.001）,雄成虫长度亦明显变短（F=94.371,P<0.001）,新生幼虫长度缩短（F=78.893,P<0.001）,肌幼虫长度缩短（F=129.492,P<0.001）。Control si RNA组与PBS组差异无统计学意义（P>0.05）。结论1.旋毛虫氨基肽酶（TsAP）在旋毛虫发育的各个时期均有表达,且主要分布于虫体皮层及雌成虫胚胎。2.rTsAP具有酶活性,在温度为50°C、p H值为8.0时酶活性最高,Mn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺对rTsAP的酶活性均有增强作用,金属蛋白酶抑制剂1,10-Phenanthroline对rTsAP的酶活性有抑制作用。3.rTsAP可与IECs特异性结合,对旋毛虫幼虫侵入IECs具有促进作用;抗rTsAP免疫血清或沉默TsAP基因可以抑制旋毛虫幼虫侵入IECs。4.TsAP在旋毛虫的侵入、发育和生殖中起着至关重要的作用,可作为抗旋毛虫疫苗的一个候选靶标。