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[目的]机体由于先天畸形、创伤、肿瘤切除以及感染等多种因素造成的体表软组织缺损,常常导致人体正常组织的形态及轮廓改变,不只影响患者容貌美观,还对患者造成一定的生理功能障碍,严重时对其心理也产生负面作用。目前虽然常常应用真皮移植、自体组织瓣移植、胶原注射、以及人工合成材料植入等多种方法修复重建缺损的组织,但仍旧不能满足临床上所有整形修复外科的需要。对软组织缺损的修复重建仍然是整形外科所面临的重大难题。现研究较多的是自体脂肪组织移植技术,但也存在较多缺点,比如移植脂肪成活率低、脂肪组织血供差、移植脂肪组织易液化被吸收需要多次反复注射等等[1,2]。因此,利用脂肪组织工程技术已然成为当下临床研究的热点。脂肪组织工程的基本原理及方法是[3]将理想的种子细胞,接种到生物性能良好的三维支架上,经体外扩增、定向诱导分化培养后,将此细胞支架复合物植入组织缺损部位。最终,支架逐渐降解,其降解产物被机体吸收,种子细胞分化为脂肪细胞,并与移植受区建立血运,从而与受区组织整合,完全填充组织缺损区域,达到修复和重建功能的治疗目的。因此,本实验从小鼠皮下及腹股沟脂肪组织中分离获得脂肪组织来源间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs),作为脂肪组织工程的种子细胞,以制备壳聚糖多孔支架为切入点,并检测其孔隙率、显微结构、机械强度以及与小鼠ADMSCs生物相容性等多项指标,旨在为脂肪组织工程寻找更加合适的支架材料,为其进一步的组织工程化脂肪的临床应用积累实验数据。[方法]1.选择实验动物:选用健康、雌性、体重20g左右、4-8周龄的C57BL/6小鼠。购自昆明医科大学动物实验中心。2.脂肪组织来源间充质干细胞原代分离、培养及鉴定:利用Ⅰ型胶原酶消化法从小鼠脂肪组织中分离提纯出ADMSCs,常规细胞培养并传代,取第4代贴壁生长的细胞制备成单细胞悬液,运用流式细胞术检测及鉴定悬浮细胞表面的分子标志物,并将其定向诱导分化为脂肪细胞、骨细胞,经油红O及茜素红染色,以鉴定其多向分化能力。3.壳聚糖支架的制备及其孔隙率、力学性能和毒性检测:通过冷冻干燥法制备壳聚糖三维多孔支架,并对壳聚糖支架进行了不同交联工艺探索(交联时间分别为2h、4h和8h)。大体观察支架性状,行扫描电镜(SEM)观察支架显微结构。乙醇排水法检测支架孔隙率。对于韧性材料,主要考察其拉伸性能。并做细胞毒性实验(MTT法),以鉴定材料有无细胞毒性。4.壳聚糖支架复合小鼠脂肪组织来源间充质干细胞:最终选取交联8h的壳聚糖支架作为复合干细胞支架。取第4代小鼠ADMSCs与壳聚糖支架体外复合培养,采用扫描电镜观察细胞在支架上的粘附生长情况。[结果]1.Ⅰ型胶原酶消化法可成功从小鼠脂肪组织中分离培养出ADMSCs,细胞贴壁生长,具有典型梭形、成纤维细胞样形态;流式细胞仪检测免疫表型,结果显示,分离培养的第4代细胞表达MSC标志分子CD44、CD90分别为98.78%±0.73%,98.31%±0.57%,而造血干细胞标志分子CD34、CD45表达阴性,这符合间充质干细胞特性。ADMSCs细胞经过成脂诱导14d后,其内出现了透明圆形脂肪粒,经油红O染色后可见橘红色脂滴;同时,经过成骨诱导培养21d后,细胞内具有钙盐沉积,经茜素红染色后呈橘红色致密结节。说明本实验成功从小鼠脂肪组织中分离得到ADMSCs。2.壳聚糖支架大体呈乳白色或微黄色,触摸有一定弹性,较柔软。扫描电镜观察支架显微结构呈多孔海绵样状,孔隙相互连接,孔径大小主要分布在25-260μm范围内,且支架材料的孔隙率达到92.8%±2.4%。经过交联处理的壳聚糖支架具有三维多孔结构,支架的拉伸强度在交联2h为(2.55±0.89)MPa、交联4h为(4.11±0.7)MPa、交联8h为(5.73±0.77)MPa,与未交联的拉伸强度(0.9±0.27)MPa 比较(p=0.04t=3.08、p=0.002t=7.38、p=0.0005t=10.19),支架材料的强度随着交联时间的增加而不断增加,且差异有统计学意义(P<0.05)。其中交联8h的壳聚糖支架拉伸强度达到最大,为5.73±0.77MPa。细胞毒性实验材料浸提液浓度0.5mg/ml时,细胞增殖度(RGR)为(98.30%±5.93%);1.0mg/ml时,细胞增殖度(RGR)为(97.03%±4.12%);1.5mg/ml时,细胞增殖度(RGR)为(99.79%±1.82%);2.0mg/ml 时,细胞增殖度(RGR)为(101.41%±3.54%)。材料浸提液各浓度实验组与阴性对照组(100±0.00)(p=0.65t=0.50、p=0.28 t=1.25、p=0.86t=0.19、p=0.53 t=0.69)比较,RGR 值统计学无显著变化(P>0.05),细胞增殖度都在90-100之间,细胞毒性为0或1级,说明壳聚糖支架材料无毒性。3.脂肪组织来源间充质干细胞与壳聚糖支架复合培养后,扫描电镜观察可见干细胞能够在支架上黏附、生长,并长出伪足,说明壳聚糖材料生物相容性良好。[结论]1.采用Ⅰ型胶原酶消化法可成功分离纯化出ADMSCs;2.利用冷冻干燥技术可以成功制备壳聚糖支架,该支架具有良好的三维空间结构,即较高的孔隙率和适宜的孔径大小。经过交联,该壳聚糖材料机械强度加强,且对细胞无毒性,生物安全性良好,可以作为组织工程的支架使用;3.细胞在壳聚糖支架上增殖、黏附良好,具有良好的生物相容性。壳聚糖作为一种理想的组织工程用支架材料,适于细胞在其上的黏附与增殖,为进一步用于软组织缺损临床修复积累实验数据。