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目的 近年来关于神经再生特别是中枢神经系统（CNS）损伤后再生的研究，一直是神经解剖学、神经生物学和神经免疫学等神经科学的研究热点。最新的研究结果揭示，哺乳动物成熟个体表现出的CNS再生能力缺乏并不是因为CNS自身不具有再生能力，而是这种能力被某种物质所强烈地抑制。目前认为这种再生抑制物质是由少突胶质细胞等分泌的一类髓鞘质蛋白，其中分子量为35，000dal的NI-35是目前所知的抑制再生能力VH最强的一种蛋白因子。已有大量研究证实，在离体细胞实验和动物实验中应用抗NI-35的单克隆抗体对NI-35进行封闭，都使CNS再生获得了成功。本实验的目的是应用分子克隆技术，将已知的抗鼠NI-35单克隆抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL基因进行重组，使二者通过一个由四个甘氨酸一个丝氨酸组成的重复序列短肽连接，构建出一种全新的抗NI-35重组单链抗体（anti-NI-35scFv），并使其在大肠杆菌中初步表达。 方法 从genebank中检索抗NI-35单克隆抗体（anti-NI-35mAb）重链可变区和轻链可变区的基因序列，设计一编码亲水性多肽接头（Gly4Ser）3的DNA片断，通过此连接肽将anti-NI-35单抗轻、重链可变区的基因连接起来，得到抗NI-35重组单链抗体基因序列。随后在此序列的两端引入BamHI和HindIII两个酶切位点，最后在轻链序列与HindIII酶切位点之间插入终止密码TAA。将设计好的抗体基因全长序列分为35个小片段分别进行人工合成，再通过改良的重叠延伸拼接法一次拼接所有的小片段，经两次PCR扩增，在体外合成anti朴I－35scFv基因全长。回收PCR产物，经凝胶电泳鉴定大小后，将目的基因插人至克隆质粒pUC4 中，构建含有目的基因的克隆载体，经转化感受态细菌大肠杆菌DH5a、氨予青霉素抗性筛选、BamHI和 Hindlll双酶切鉴定，LZ F primer（M13F：5’－TGT AAA ACG ACG GCC AGT－3’）和 R primer（M13R：5’－CAG GAA ACA GCT ATG ACC－3’）为通用引物进行菌落PCR粗测及最终的DNA测序证实准确后，将目的基因酶切回收，连接至表达质粒pET毛8a（＋）中，构建含有目的基因的表达载体，同样经过转化感受态细菌大肠杆菌BInl、卡那霉素抗性筛选。BamHI和 Hindlll 双酶切鉴定，以 T7 promoter primer（5’－TAA TACGAC TCA CTA TAG GG－3’）、’I7 terminator primer（5’－TGC TAG’IVfA ’ITG CTC AGC GG－3’）为引物进行菌落 PCR粗测正确后，37 t摇菌扩增，测菌密度至 OD＿为 0．6时，加人 InyG诱导表达。继续培养至5小时，分别于诱导前、诱导后1小时、诱导后2小时和诱导后3小时四个时间点对实验组和对照组取样，诱导后4j小时只对实验组取样，随后对表达产物进行SDSIAGE初步检测。 结 果 含有目的基因的克隆载体经 DNA序列分析后表明，antiwI－35SCFv基因全长729 hp，其中 VH 363 hp，位于整个序列的上游，编码 121个氨基酸；V一 hp，位于整个序列的下游，编码 107个氨基酸；中间以45 hP的连接肽相连。最终合成的基因序列与预先设计的基因序列仅有一个碱基的差异，即429位点的C被替换成了T，准确率为99．9％。SDSIAGE检测显示，表达产物为antiwI－35SCFV与m叶ag的融合蛋白，其相对分子量是31 KD，与预期结果一致，并在大肠杆菌中得到了较高水平的表达。 ·2· 结 论 成功构建了抗NI35重组单链抗体（anh刀I－35scFv）基因克隆载体与表达载体，并在大肠杆菌中获得较高水平的表达。