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背景肝细胞癌是常见的恶性肿瘤,病情隐匿且易转移复发。我国每年新增确诊肝癌患者和因肝癌死亡人数都持续增加,远高于世界平均水平。目前肝癌治疗方法包括外科治疗、放射治疗、系统治疗等多种手段,其中以化疗药物为基础的系统治疗是肝癌治疗中重要的手段,尤其是针对不能进行外科治疗的病人或者对于晚期肝癌病人。索拉非尼作为系统治疗中推荐使用的一线药物,增加患者生存获益的同时,其耐药问题也一直十分突出。因此,继续开发研制新的抗癌药物十分重要。相比于传统新药开发路线,“老药新用”有其不能比拟的优势——研发周期短、临床数据丰富、成本低等。双硫仑是美国食品和药品管理局批准用治疗酒精成瘾的药物,已广泛使用超过60年,具有完善的药代动力学、安全性和耐受性等多方面患者数据资料。近年来有文献报道,双硫仑体内代谢产物——CuET在临床和临床前研究中均展示良好的抗癌活性。但CuET在肝癌治疗中的研究很少,且肝脏是双硫仑的主要代谢器官,因此我们将对CuET对肝癌细胞增殖与凋亡的影响及其分子机制进行深入探讨,以期为双硫仑“老药新用”提供新的思路,同时也为CuET成为临床肝癌治疗药物提供理论与实验依据。目的阐明CuET抑制肝癌细胞HepG2、SMMC-7721增殖诱导凋亡的分子机制,以期为CuET成为临床肝癌治疗药物奠定基础。方法MTT比色法和软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖;流式细胞术检测ROS和细胞凋亡;Western Blot实验检测凋亡相关和线粒体分裂相关蛋白表达;激光共聚焦观察线粒体分裂和Drp1与线粒体共定位;透射电镜观察线粒体形态。内容与结果1.CuET抑制肝癌细胞增殖诱导凋亡MTT检测发现CuET可以抑制不同类型肿瘤细胞增殖,其中对肝癌细胞Hep G2、SMMC-7721效果更明显（P<0.01）,但对正常肝细胞THLE增殖没有影响（P<0.01）。软琼脂克隆形成实验也证实CuET对肝癌细胞增殖具有抑制作用（P<0.01）。流式细胞术和Western Blot检测表明,CuET可诱导肝癌细胞Hep G2、SMMC-7721凋亡（P<0.01）并促进凋亡关键蛋白细胞色素C释放到胞浆,Caspase 3和Caspase 9剪切活化,PARP降解。2.CuET促进线粒体过度分裂诱导线粒体损伤透射电镜观察发现,CuET处理后,Hep G2和SMMC-7721细胞线粒体数量减少（P<0.01）,且剩余线粒体出现肿胀、断裂和嵴扭曲变形。激光共聚焦显微镜观察发现,CuET处理后导致细胞线粒体发生过度分裂（P<0.01）,断裂呈“点状”。3.CuET通过促进Drp1 Ser637位点去磷酸化、Drp1线粒体转位,引发线粒体过度分裂和细胞凋亡Western Blot检测发现CuET可导致Drp1 Ser637位点去磷酸化以及Drp1线粒体转位,均呈现良好的剂量和时间依赖性,但对Drp1 Ser616位点磷酸化水平无明显影响。紧接着,采用Drp1线粒体转位抑制剂Mdivi-1预处理细胞,预处理后可明显阻断CuET引起的Drp1线粒体转位,减少细胞凋亡（P<0.01）。通过sh RNA技术敲降Drp1,发现敲降Drp1蛋白后,肝癌细胞线粒体不再过度分裂（P<0.01）,分裂融合重新恢复平衡,细胞凋亡明显减少（P<0.01）;通过点突变技术,构建Drp1 637A、Drp1 637D质粒分别模拟Drp1 637位点去磷酸化状态和磷酸化状态,发现转染Drp1 637D质粒在恢复Drp1Ser637位点磷酸化水平的同时,也直接阻断CuET引起的Drp1线粒体转位,避免了线粒体分裂-融合平衡遭到破坏,极大地减少了CuET引起的细胞凋亡（P<0.01）;而转染Drp1 637A质粒效果与之相反,不仅加剧Ser637位点去磷酸化以及Drp1线粒体转位的程度,而且进一步导致线粒体损伤断裂,促进CuET诱导的细胞凋亡（P<0.01）。4.CuET通过增加肝癌细胞线粒体超氧型ROS水平,促进Drp1 Ser637位点去磷酸化和Drp1线粒体转位,进而导致线粒体分裂和细胞凋亡流式细胞术检测发现,CuET可导致肝癌细胞内ROS水平上升（P<0.01）,且ROS为超氧阴离子（O2）型ROS,主要来自于线粒体。采用线粒体超氧阴离子清除剂Mito Q预处理细胞,预处理后直接阻断CuET引起的线粒体内O2水平升高（P<0.01）,恢复Drp1 Ser637位点磷酸化水平,同时抑制Drp1线粒体转位,进而维持线粒体分裂-融合平衡,减少CuET引起的细胞凋亡（P<0.01）。结论CuET诱导肝癌细胞线粒体分裂和细胞凋亡。CuET刺激肝癌细胞线粒体内超氧型ROS水平升高,促使Drp1 Ser637位点去磷酸化,继而解除对Drp1线粒体转位的抑制,促进其大量转位至线粒体;转位后,破坏线粒体分裂-融合平衡,导致线粒体分裂加剧,释放细胞色素C;释放到胞浆中的细胞色素C,传递凋亡信号,激活Csaspase凋亡通路,最终导致细胞凋亡。