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结直肠癌是世界上第三大常见的肿瘤，并且是世界上死亡率第四的肿瘤。MicroRNA(miRNA)是细胞内广泛存在的非编码RNA，长度约为18-25个碱基。近期报道显示在多种肿瘤中均有miR-34a的沉默现象，部分结直肠癌患者外血中miR-34a水平下调，然而，目前为止在结直肠癌中发现的miR-34a靶基因有且仅有两个，其在结直肠癌中的具体作用机制并没有详细的研究。 目的： 本课题旨在揭示miR-34a在结直肠癌中的作用机制，筛选并验证其作用靶点，为临床抗结直肠癌侵袭、转移提供新的miRNA和基因靶点。 方法： 1、miR-34a对结直肠癌生物学行为的影响 2、miR-34a作用靶基因的预测、筛选及验证。 3、miR-34a及FMNL2/E2F5在结直肠癌组织中的表达及相关性分析 结果： 1、miR-34a抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭及转移 (1)荧光定量PCR结果显示，在6株结直肠癌细胞中，miR-34a表达水平存在显著差异(F=767.9，P＜0.0001)，在HCT116细胞株中miR-34a表达量最高，，SW480次之，HT29及LS174T居中，而在LOVO细胞株中其表达量则最低，根据以上结果，我们选择了对HCT116和SW480细胞进行干扰miR-34a，SW480和LOVO细胞过表达miR-34a处理，以进行后续研究。 (2)在miR-34a高表达的HCT116细胞株及SW480中瞬时转染miR-34ainhibitor片段，在miR-34a低表达的LOVO细胞株及SW480中瞬时转染miR-34amimic片段后，荧光定量PCR结果显示干扰效率分别为0.324，0.136(p＜0.001，p＜0.001);过表达效率分别为3.824、3.658(p=0.0069，p＜0.001)。二者均为有效干扰片段及过表达片段。 (3) CCK8结果显示:在HCT116及SW480中干扰miR-34a后结直肠癌细胞增殖能力显著增强(P＜0.001，P＜0.001);而在过表达miR-34a后，LOVO、SW480两株结直肠癌细胞增殖能力与NC组相比，亦存在显著差异(P＜0.001，P＜0.001)。 (4)Boyden侵袭小室结果显示:与NC组相比，miR-34a inhibitor组SW480及HCT116细胞穿膜数目均显著降低。而与NC组相比，过表达miR-34a后LOVO及SW620细胞的穿膜数目显著上调。以上提示miR-34a可以抑制结直肠癌细胞的体外侵袭能力。 (5)细胞周期实验结果显示:与NC组相比，miR-34a组G1期的细胞比例明显增加;S期的细胞比例明显减少; G2/M期的细胞比例明显增加;miR-34a inhibtor组与NC组相比，G1期的细胞比例明显减少;S期的细胞比例明显增加;G2/M期的细胞比例明显减少;提示miR-34a能抑制癌细胞从G1向S期演进，从而抑制细胞增殖能力。 (6)细胞凋亡实验结果显示:与LOVO/NC及SW480/NC组相比，LOVO/miR-34a及SW480/miR-34a组早期细胞凋亡率明显升高。而与SW480/NC、HCT116/NC组相比，SW480/miR-34a inhibitor、HCT116/miR-34a inhibitor组早期细胞凋亡率明显下调，表明miR-34a能促进结直肠癌细胞凋亡的发生。 (7)成功构建SW480/miR-34a稳定株，荧光定量PCR验证其过表达效率为17.41(t=22.04, p＜0.001)。 (8)裸鼠皮下成瘤实验结果显示:miR-34a组皮下肿瘤直径较对照组明显减少(t=3.244，P=0.018);且SW480/miR-34a组皮下肿瘤的Ki67阳性细胞百分比明显低于对照组SW480/NC，以上结果表明miR-34a抑制肿瘤细胞的体内增殖能力。 (9)裸鼠尾静脉转移实验结果表明:两组中裸鼠仅在肺脏表面则可见明显的转移灶。SW480/NC组中裸鼠肺脏转移率为100％(6/6)，SW480/miR-34a组的肺脏转移率为66.6％(4/6);SW480/miR-34a组发生肺转移灶的数目明显少于对照组(t=2.789，P=0.0164)，提示miR-34a可抑制结直肠癌细胞的体内转移能力。 2、miR-34a通过FMNL2及E2F5抑制结直肠癌的增殖、侵袭 (1)以miR-34a为检索词，在miRanda、TargetScan、DIANA-microT、Pictar4个数据库进行miR-34a的作用靶基因预测，得出其可能的靶基因FMNL2、E2F5、MET、DLL1、NAV3。 (2)荧光素酶报告系统结果显示:miR-34a与FMNL2-3' UTR及E2F5-3' UTR结合后的荧光素酶活性均显著降低(F=21.75，P=0.0018，F=6.851，P=0.028;F=17.23，P=0.003，F=14.23，P=0.029)，而另外3个预测靶基因MET、DLL1及NAV3双萤光素酶活性则无显著变化(p＞0.05)证明miR-34a能与FMNL2及E2F5基因3' UTR区结合，从而抑制了萤光素酶的活性。 (3) Western-blot结果显示:过表达miR-34a后，FMNL2及E2F5蛋白表达水平下降，而在干扰miR-34a后，靶基因FMNL2及E2F5蛋白表达水平均上调了。进一步表明FMNLE及E2F5为miR-34a在结直肠癌中的靶基因。 (4)用CCK-8检测SW480细胞株中NC组、miR-34a组、miR-34a/FMNL2组以及miR-34a/E2F5体外增殖能力变化同时绘制生长曲线。析因方差分析统计结果显示:与NC组对比，miR-34a组的增殖速度明显降低(P＜0.001)，而miR-34a/FMNL2组及miR-34a/E2F5组能有效逆转miR-34a对结直肠癌细胞的抑制增殖作用(P＜0.001;P＜0.001)，结果表明，miR34通过作用于靶基因FMNL2及E2F5抑制结直肠癌细胞的增殖能力，而FMNL2与E2F5能有效逆转其对结直肠癌细胞增殖能力的抑制作用。 (5) Boyden Transwell小室检测NC、miR-34a mimic; miR-34a/FMNL2及miR-34a/E2F5细胞体外侵袭能力，结果显示miR-34a/FMNL2组及miR-34a/E2F5均能有效逆转miR-34a对结直肠癌细胞的抑制侵袭作用(F=202，P＜0.001;F=218,P＜0.001。 (6)流式细胞仪检测NC、miR-34a mimic; miR-34a/FMNL2及miR-34a/E2F5对细胞的细胞周期影响，独立样本T检验分析显示:在SW480过表达miR-34a后，miR-34a组与NC组相比，G1期的细胞比例明显增加;S期的细胞比例明显减少;G2/M期的细胞比例明显增加;在过表达miR-34a并恢复FMNL2及E2F5表达后，G1期的细胞比例明显减少(p＜0.001，p＜0.001);S期的细胞比例明显增加(p=0.001，p＜0.001); G2/M期的细胞比例明显减少(p=0.005，p＜0.001;提示miR-34a能抑制癌细胞从G1向S期演进，从而抑制细胞增殖能力，而FMNL2及E2F5可有效逆转miR-34a对结直肠癌细胞的周期阻滞作用。 (7)流式细胞仪检测NC、miR-34a mimic; miR-34a/FMNL2及miR-34a/E2F5对结直肠癌细胞凋亡的影响。结果显示，与SW480/NC相比，SW480/miR-34a组早期细胞凋亡率明显升高，而在过表达miR-34a的同时恢复FMNL2/E2F5的表达，则可有效逆转miR-34a对结直肠癌细胞的促凋亡作用(F=1867，p＜0.01，F=384.1，p＜0.001)。 3、miR-34a及FMNL2/E2F5在结直肠癌组织中的表达及相关性分析 (1)荧光定量PCR结果显示:在30对配对结直肠癌组织中，miR-34a在结直肠癌组织中表达明显低于正常黏膜组织(t=2.336，p=0.0241)。临床病理分析显示:miR-34a与患者年龄、性别、肿瘤大小，浆膜浸润、肿瘤分化以及Duke分期均没有统计学上的相关性(p＞0.05)，而与淋巴结转移存在相关性(t=-1.727，p=0.01)。 (2)Western Blot结果显示:FMNL2、E2F5在30对配对结直肠癌组织中的表达明显上调。 (3) Spearman相关性分析结果显示，miR-34a与FMNL2及E2F5在结直肠癌中表达均呈负相关关系(r=-0.971，P＜0.0001;r=-0.9216，P＜0.001)。 结论： 1、MiR-34a可以抑制结直肠癌的增殖、侵袭及转移。 2、MiR-34a在结直肠癌中的直接作用靶基因为FMNL2及E2F5，miR-34a通过FMNL2及E2F5抑制结直肠癌细胞增殖和侵袭能力。 3、MiR-34a在结直肠癌组织中表达下调，而FMNL2及E2F5表达上调;miR-34a与FMNL2及E2F5在结直肠癌中均呈表达负相关。