论文部分内容阅读
再生障碍性贫血（再障）是一种病因不明的骨髓功能障碍综合征。产生IFN-γ的CD4+Th1细胞对造血干细胞的免疫破坏是其主要的发病机制。然而目前对于控制再障中破坏骨髓的Th1细胞的分子生物学机制仍然尚未阐明。Ezh2是一个可以修饰染色体的组蛋白甲基转移酶，主要通过沉默基因表达来调控多种细胞途径，在某些T细胞炎症反应中也发挥重要作用。为了阐明Ezh2是否介导再障中的病理性Th1炎症反应及其机制，我们运用了人类再障的小鼠模型来研究阻断Ezh2对于CD4+Th1细胞的影响。在成熟T细胞中条件性敲除Ezh2基因显著降低了小鼠再障模型中破坏骨髓的Th1细胞的产生，减少了骨髓侵润Th1细胞，骨髓增生障碍不再发生，使小鼠免于发病。阻断Ezh2导致Tbx21和Stat4（分别编码T-bet和STAT4转录因子）表达的明显下降。外源性引入T-bet能修复Ezh2缺失的T细胞达到最佳Th1分化，而STAT4则不能。Ezh2在Th1细胞中与Tbx21启动子区域相结合，可以直接激活Tbx21转录。同时，Ezh2在Th1细胞中还参与防止蛋白酶体介导的T-bet蛋白的降解，在转录后水平对T-bet进行调控。本研究证明了T-bet作为Ezh2转录及转录后水平的调控对象，共同作用介导再障中破坏骨髓的Th1细胞的产生，并且为将来把阻断Ezh2作为新的治疗策略运用于再障及其他相关自身免疫性疾病提供了基础。具体实验内容如下：第一部分：小鼠再生障碍性贫血的产生依赖于Ezh21. T细胞特异性Ezh2基因敲除（T-KO）小鼠的建立。2.人再障小鼠模型的建立。3.阻断Ezh2对再障小鼠模型的影响。结论：小鼠再生障碍性贫血的产生依赖于Ezh2，阻断Ezh2使小鼠免于发病。第二部分：诱导小鼠再生障碍性贫血的Th1细胞分化需要Ezh21.再障小鼠供者CD4+T细胞的表型检测。2.再障小鼠供者CD4+T细胞的基因表达检测。3.不同时间点追踪检测供者细胞的增殖分化情况。结论：再障小鼠模型体内主要诱导致病性Th1细胞分化；Ezh2对调节Th1细胞起到关键作用，但对Th2或Th17细胞影响甚少。第三部分：Ezh2在体外培养条件下促进Th1细胞分化1. Ezh2基因敲除T细胞的体外活化、分裂和增殖检测。2.建立诱导野生型（WT）和T-KO Th1细胞分化的体外培养体系。3.体外WT和T-KO Th1细胞的表型检测。4. Ezh2对Th1细胞分化的促进作用不依赖于IL4和GATA3。结论：Ezh2基因敲除对CD4+细胞体外分裂、增殖和活化基本没有影响；Ezh2在体外诱导Th1条件下能促进Th1细胞的分化；Ezh2对Th1细胞的促进作用不依赖于IL4和GATA3。第四部分：Ezh2与Th1相关基因位点关联1.幼稚T细胞和Th1细胞的Th1相关基因位点上组蛋白甲基化标志的检测。2.幼稚T细胞和Th1细胞的Th1相关基因位点上Ezh2的结合情况。3.幼稚T细胞和Th1细胞Ezh2和Th1相关基因的表达检测。4.体外诱导Th1细胞Ezh2和IFN-γ的共表达情况。5. WT和T-KO Th1细胞Th1相关基因位点上组蛋白甲基化标志的检测和Ezh2的结合情况。结论：在幼稚T细胞向Th1细胞分化过程中，Th1相关基因位点上抑制型H3K27me3标志下降，活化型H3K4me3标志上升，然而Ezh2却始终结合在相关位点上；Ezh2在Th1细胞中与Th1相关基因表达呈正相关并且所有表达IFN-γ的CD4+细胞也高表达Ezh2；虽然T-KO Th1细胞中Th1相关基因上活化型组蛋白甲基化标志明显高于WT Th1细胞，但Ezh2缺失却使Th1细胞分化受损。第五部分：Ezh2在转录及转录后水平调控T-bet表达1. WT和T-KO Th1细胞T-bet及STAT4通路相关基因的表达检测。2. Tbx21双荧光素酶报告基因系统的建立及检测。3. WT和T-KO Th1细胞T-bet及STAT4蛋白水平检测。4.加入蛋白酶体抑制剂对WT和T-KO Th1细胞T-bet蛋白水平的影响。结论：Ezh2促进T-bet mRNA的表达；Ezh2可以直接激活Tbx21转录；Ezh2基因敲除Th1细胞T-bet蛋白表达水平显著下降，程度远大于转录水平的下降；加入蛋白酶体抑制剂可以修复T-KO Th1细胞T-bet蛋白水平至WT水平。第六部分：T-bet在Ezh2缺失情况下修复Th1细胞达到最佳分化1. MigR1-GFP、MigR1-T-bet及MigR1-STAT4逆转录病毒的制备及感染T细胞。2.病毒感染Th1细胞的表型检测。3.分选GFP阳性细胞的基因表达检测。结论：外源性引入T-bet能够完全修复T-KO Th1细胞IFN-γ的表达至WT Th1细胞水平，但STAT4只能部分修复。第七部分：T-bet使Ezh2缺失的供者淋巴细胞恢复介导再生障碍性贫血的能力1. MigR1-GFP、MigR1-T-bet及MigR1-STAT4逆转录病毒的制备及感染T细胞。2.感染的T细胞移植入再障模型后的存活情况观察和外周血及骨髓细胞计数。3.异位表达T-bet或STAT4的供者CD4+T细胞的表型检测。结论：外源性引入T-bet能够在小鼠再障模型中修复T-KO Th1细胞分化，部分恢复其介导再生障碍性贫血的能力。