棉花黄萎病是危害棉花最严重的病害之一,目前尚无有效的化学防治手段,选育抗病品种是解决棉花黄萎病最经济有效的途径。棉花抗黄萎病鉴定是黄萎病抗性遗传研究和育种抗病材料筛选最关键的环节。然而经典的棉花黄萎病抗性鉴定方法建立在对棉花根系造成人为创伤后,使病原菌快速侵入维管束的基础之上,鉴定结果受创伤程度,发病条件、环境因素以及操作过程等影响较大,棉花发病不一致,容易产生假抗性,影响鉴定结果的准确性。而且传统的棉花黄萎病抗性鉴定需在黄萎病症状出现后才能进行,不能观测黄萎病病症出现前病原菌的侵入和扩展进程。黄萎病抗性的遗传和分子机制尚不明确,加之陆地棉抗黄萎病抗病种质匮乏,棉花抗黄萎病品种选育进展缓慢。本研究首先以具有不同抗病性的陆地棉TM-1及海岛棉7124为植物材料,采用转GFP基因的大丽轮枝菌培养基定量接种方法,研究大丽轮枝菌的侵染机制和进程以及棉花黄萎病抗性的快速、精准鉴定方法,在此基础上,通过棉花受大丽轮枝菌侵染后的转录组及磷酸蛋白质组学研究,分析受黄萎病侵染过程中棉花基因表达及蛋白质翻译后磷酸化修饰的变化,为鉴定大丽轮枝菌侵染早期棉花抗(感)病关键基因和关键磷酸化蛋白质(位点),解析棉花感染大丽轮枝菌的分子机制提供新的线索。主要研究结果如下:1、将转GFP基因的大丽轮枝菌与培养基定量接种相结合,可以准确鉴定棉花黄萎病发病过程及其抗性。以转GFP基因的大丽轮枝菌Vd991-GFP-2为病原菌,分别接种耐黄萎病的海岛棉海7124和感病品种TM-1,分析大丽轮枝菌GFP荧光在棉花组织中的定殖分布状态和棉花发病情况,发现海7124体内各部分的GFP荧光强度远低于TM-1,侵染6d后,TM-1根、茎和叶片中均检测到GFP荧光,而海7124仅在根中可以检测到GFP荧光,且海7124病指显著低于TM-1,说明海7124对大丽轮枝菌具有一定的抗入侵和较强的抗扩展能力。2、通过RNA-seq转录组测序比较接种与未接种大丽轮枝菌的陆地棉TM-1根茎的转录水平差异,获得了 935个差异表达基因,其中651个基因受大丽轮枝菌上调表达,284基因下调表达。差异表达基因富集分析结果显示大丽轮枝菌可以诱导苯丙氨酸代谢途径增强、木质素累积;WRKY、MYB转录因子、细胞色素P450、E3泛素连接酶等基因上调表达,这些基因可能在棉花相应抗黄萎病胁迫激发棉花的抗性机制起重要作用。为进一步揭示棉花抗黄萎病分子机制提供了候选基因。3、优化建立了适宜于棉花磷酸化蛋白质提取和富集方法。比较分析了两种不同蛋白质提取和酶切方法、三种磷酸肽富集方法、不同总蛋白量起始量以及亲和色谱过程中添加不同修饰性羟酸等不同因素对于磷酸肽富集数量和专一性的影响。结果表明,超滤辅助制备肽段样品(FASP)蛋白质提取方法,以Ti02为基质的固相金属离子亲和色谱法,富集得到的磷酸肽数目最多;孵育过程中,乳酸的加入可以提高Ti02的富集效率和特异性,在一定的范围内,富集到的磷酸肽数量与蛋白起始量成正比。4、采用上述优化的棉花磷酸化蛋白质富集方法,结合无标记(Label-free)定量方法,定性及定量的分析了接种大丽轮枝菌后24h,TM-1根茎磷酸化蛋白质的变化,共鉴定到262个差异磷酸化蛋白质。这些蛋白质主要参与胞吞作用、糖酵解/糖异生作用、淀粉与蔗糖代谢,碳素代谢和次生代谢物合成等生物学过程。此外,响应脱落酸的信号转导和泛素介导的蛋白质降解可能在TM-1对大丽轮枝菌的抗性反应中发挥重要作用。为进一步分析棉花黄萎病抗性分子机制提供了新的线索和候选蛋白质。