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第一部分高糖对RANKL诱导后的RAW264.7细胞增殖和破骨分化的影响目的:用RANKL诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞分化为成熟的破骨细胞,探讨高糖环境下对RANKL诱导后的破骨细胞的影响。方法:体外培养RAW264.7细胞,用50ng/ml RANKL配成诱导培养基去诱导细胞,分组如下:空白对照组(无RANKL)、Control组(葡萄糖5.5mmol/L+RANKL),实验组(以不同浓度梯度的葡萄糖11,22,33,44mmol/L+RANKL)培养细胞6d:用MTT法测定细胞活力和Western blot法检测Cyclin D1蛋白水平的表达;用TRAP染色和OAAS法,观察破骨细胞内TRAP+细胞形成情况和骨陷窝面积大小。结果:MTT结果显示,与Control组相比,高糖(22m M)可以显著促进破骨细胞的活力(P<0.01),而在11,33,44mmol/L时并无显著性差异;Western Blot的结果显示,与Control组相比,高糖(22mmol/L)组上调Cyclin D1的表达最明显;TRAP染色法结果显示,与Control组相比,高糖抑制了破骨细胞的分化,且呈一定的浓度-依赖性(P<0.01);OAAS法结果显示,与Control组相比,高糖抑制了破骨细胞的吸收,且呈一定的浓度-依赖性(P<0.01)。结论:高糖(22m M)可明显促进RANKL诱导后的RAW264.7细胞的增殖,同时高糖以剂量依赖的方式抑制其破骨分化功能。第二部分高糖调节RANKL诱导后的RAW264.7细胞破骨分化的机制探索目的:用RANKL诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞分化为成熟的破骨细胞,探索高糖环境下对RANKL诱导后的破骨细胞的形成机制。方法:1.体外培养RAW264.7细胞,用不同浓度的葡萄糖联合RANKL去培养细胞24h:用Western blot法检测PI-3K,p Akt/Akt的表达。2.体外培养RAW264.7细胞,为确定高糖(22m M)对RANKL诱导后的破骨细胞的增殖最显著,而在33,44m M时是下降的,是否受到高渗的影响,用RANKL诱导,培养细胞6d:用MTT法检测细胞的活力和Western blot法检测Cyclin D1的表达。3.体外培养RAW264.7细胞,为了探索氧化应激对破骨细胞的形成作用,用RANKL诱导,培养细胞24h:用荧光显微镜检测细胞内的活性氧水平;检测细胞内氧化应激四个指标CAT、GPX、SOD、MDA的含量。结果:1.Western Blot的结果显示:用不同浓度葡萄糖处理,与Control相比,高糖组的PI-3K和p-AKt/Akt蛋白水平以剂量依赖的方式增加,但44mmol/L葡萄糖组上升程度更显著(P<0.01)。2.为确定高糖(22m M)对RANKL诱导后的破骨细胞的增殖最显著,而在33,44m M时是下降的,是否受到高渗的影响。结果显示:与Control组相比,高糖(22m M)组对破骨细胞的增殖最明显(P<0.01),不同高糖与高渗组成的22m M浓度和33m M浓度对细胞增殖无显著性差异(P﹥0.05)。与Control组相比,高渗的11,22,33,44m M组以剂量依赖性的方式抑制了破骨细胞的增殖和Cyclin D1蛋白水平的表达(P<0.01)。因此,高渗以剂量依赖方式抑制细胞Cyclin D1的表达,抑制细胞增殖,和不同浓度的高糖通过上调PI-3K和p-AKt的表达以剂量依赖的方式促进细胞增殖,不同高糖与高渗组成的不同浓度对细胞增殖没有影响,这表明高糖(22m M)促进破骨细胞的增殖,而在33,44m M时是下降的,与高渗有关。3.ROS检测结果显示:与Control组相比,11,22,33,44m M组均能显著降低破骨细胞内ROS水平(P<0.01);这表明高糖能显著抑制RANKL诱导后的破骨细胞内的活性氧水平。4.观察高糖(22m M)预处理对诱导前和诱导后的破骨细胞内CAT、GPX、SOD和MDA的影响:与空白对照组相比,RANKL组和高糖(22m M)组单独处理RAW264.7细胞后,细胞内的CAT、GPX及SOD含量显著降低,MDA水平显著升高(P<0.01);与Control组相比,当高糖(22m M)组和RANKL联合作用于RAW264.7后,细胞内CAT、GPX及SOD含量显著升高,MDA水平显著降低(P<0.01)。5.观察不同高糖预处理对RANKL诱导后的破骨细胞内CAT和MDA的影响:与Control组相比,11,22,33,44m M组细胞内CAT含量显著升高,MDA水平显著降低(P<0.01),但是细胞内GPX和SOD水平没有明显变化。结论:1.高糖促进RANKL诱导的RAW264.7细胞的增殖,其机制与上调PI3K/Akt通路有关,与高渗有关。2.高糖抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞的分化和骨吸收,其机制可能与抑制氧化应激有关。