目的:骨质疏松症作为一种代谢性骨病,其患病率在全球呈逐年上升趋势。目前,在我国50岁以上人群中,骨质疏松症女性患病率为20.7%,男性为14.4%,并且患病率仍有逐年上升趋势[1]。由此造成的骨折的发病率也逐年升高,导致患者的生活质量显著降低[2,3]。因此,关于骨代谢性疾病发病机制以及干预治疗的方法的研究越来越受到重视。骨组织终身不断进行着旧骨被吸收和新骨形成的骨重建过程。在骨重建周期中,由破骨细胞引起的“骨吸收”与成骨细胞引起的“骨形成”间的“耦联”,是维持骨结构完整性及合适骨强度的关键环节[4,5]。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞,其具有合成骨特异的基质蛋白的作用（包括I型胶原蛋白、骨磷酸蛋白、骨钙素）。在成骨过程中成骨细胞一旦被周围骨基质所包埋,即成为骨细胞。最新的研究显示,成骨细胞代谢的能量主要来源于葡萄糖代谢[6]。葡萄糖的摄取主要依靠葡萄糖转运蛋白。成骨细胞上表达的葡萄糖转运蛋白有三种:GLUT1（glucose transporter 1）,GLUT3（glucose transporter 3）,GLUT4（glucose transporter 4）[7,8]。其中GLUT1在成骨细胞上的表达水平比其他转运蛋白的表达高出2个数量级,是成骨细胞葡萄糖摄取的主要转运载体。动物实验显示,GLUT1介导的葡萄糖摄取在成长过程中对成骨细胞的分化有着重要的意义,成骨细胞GLUT1-/-的大鼠在出生前表现为骨形成障碍,在出生后表现为骨质疏松和葡萄糖不耐受[6]。能否通过调节GLUT1的表达和活性,增加成骨细胞的葡萄糖代谢,从而改善骨形成,需要进一步的研究解决。骨钙素（osteocalcin,OC）是骨中含量最丰富的非胶原蛋白之一[9],由成熟的成骨细胞合成。在成骨细胞中,在内质网经蛋白翻译后,经γ-谷氨酰羧化酶催化骨钙素17、21和24位点的谷氨酸（Glu）残基发生羧基化。在实际情况中,仍有少量的骨钙素未被羧化完全,有一个、二个或三个位点的Glu残基未被羧化,这种骨钙素被称为羧化不全骨钙素（undercarboxylated osteocalcin,ucOC）。在酸性条件下,羧化骨钙素的Gla残基还会发生脱羧化,转化为脱羧化骨钙素（decarboxylated osteocalcin,dcOC）[10]。羧化不全骨钙素和脱羧化骨钙素统称为非羧基化骨钙素（uncarboxylated osteocalcin,Glu OC）,与能量代谢密切相关[11]。既往的研究证实G蛋白偶联受体C族6亚型A（G protein-coupled receptor family C group 6 subtype A,GPRC6A）是羧基化骨钙素和Glu OC的受体,参与了机体的生理反应和葡萄糖代谢[12,13]。体外实验研究结果显示,使用Glu OC孵育骨骼肌细胞、脂肪细胞可促进肌管和脂肪细胞的葡萄糖摄取[14,15]。既然Glu OC可以增加多种细胞的葡萄摄取,那么dcOC作为一种Glu OC,是否也可以增加成骨样细胞的葡萄糖摄取,从而改善骨形成,目前尚不清楚。既往的研究结果显示,PI3K/Akt（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B）和HIF-1α（hypoxia-inducible factor-1α）信号通路的激活与GLUT1介导的葡萄糖摄取密切相关[16,17]。dcOC能否通过PI3K/Akt通路和HIF-1α,增加成骨样细胞的葡萄糖摄取,目前还不清楚,需要进一步的实验验证。本研究拟通过在体外应用dcOC短时间和长时间干预MG63细胞（人成骨细胞样肉瘤细胞）,观察细胞的葡萄糖摄取、细胞增殖、分化的变化,同时探索可能参与调节的信号通路。在体内对小鼠进行dcOC腹腔注射,观察dcOC对于小鼠糖代谢,骨形成标志物及骨密度、骨微结构的影响,为骨质疏松等代谢性骨病的治疗提供新的干预靶标及研究策略。本研究分为如下三部分进行:第一部分:dcOC通过GLUT1对MG63细胞葡萄糖摄取影响的研究。第二部分:PI3K/Akt信号通路及HIF-1α在脱羧化骨钙素调节MG63细胞葡萄糖摄取中作用的研究。第三部分:dcOC对小鼠骨形成及微结构影响的研究。研究方法:1、体外培养MG63细胞、HEK-293细胞及Jurkat细胞。实验前当天制备浓度为0、0.3、3、10、30ng/ml的dcOC培养液。应用不同浓度的dcOC干预MG63细胞1小时或72小时。2、Western blot方法验证MG63细胞表达GPRC6A受体（以HEK-293细胞作为阴性对照,Jurkat细胞作为阳性对照）。3、流式细胞技术测定dcOC干预后MG63细胞摄取2-脱氧葡萄糖（2-deoxy-2-[（7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl）amino]-D-glucose,2-NBDG）的荧光强度的变化,确定dcOC干预MG63细胞1小时或72小时对葡萄糖摄取影响的最适浓度。4、Western blot方法测定dcOC干预1小时或72小时后GPRC6A、Akt、p-Akt（phospho-protein kinase B）、HIF-1α、GLUT1、Runx2（runt-related transcription factor2）的蛋白表达水平。5、用PI3K的抑制剂LY294002抑制PI3K的活性,用dcOC干预MG63细胞1小时,之后流式细胞技术测定细胞摄取2-NBDG的荧光强度的变化,Western blot方法测定Akt、p-Akt、GLUT1蛋白表达水平。6、用siRNA静默HIF-1α,用dcOC干预MG63细胞72小时,之后流式细胞技术测定细胞摄取2-NBDG的荧光强度的变化,Western blot方法测定HIF-1α、GLUT1蛋白表达水平。7、用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）方法检测dcOC对MG63细胞增殖的影响。8、用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性检测试剂盒来检测dcOC对MG63细胞ALP活性的影响。9、将昆明小鼠分为3组,分别给予为期8周不同剂量（0ng/g/d,3ng/g/d,30ng/g/d）dcOC日一次腹腔内注射。处死前称重。10、全自动生化分析仪测定小鼠空腹血糖、血清钙离子、血清磷离子水平。11、酶联免疫吸附试验（ELISA法）测定小鼠空腹胰岛素、血清骨保护素（osteoprotegerin,OPG）及1型原胶原N-端前肽（procollagen 1 N-terminal propeptide,P1NP）水平。12、免疫组化方法验证小鼠成骨细胞中GPRC6A受体及GLUT1蛋白的表达,及dcOC对其表达的影响。13、MicroCT断层扫描小鼠股骨的骨皮质密度（Cortex BMD）、骨小梁密度（Trabeculae BMD）,骨体积/组织体积（BV/TV）,骨小梁厚度（Tb.Th）和小梁数量（Th.n）。结果:1、Western blot方法验证GPRC6A受体的表达:结果显示HEK-293细胞作为阴性对照,无GPRC6A受体表达;Jurkat细胞作为阳性对照,有GPRC6A受体表达;MG63细胞有GPRC6A受体表达。2、不同浓度的dcOC干预MG63细胞1小时或72小时,均可增加MG63细胞对2-NBDG摄取,且呈一定程度的剂量依赖性。dcOC干预1小时调节MG63细胞对2-NBDG摄取的最适浓度为3ng/ml,dcOC干预72小时调节MG63细胞对2-NBDG摄取的最适浓度为10ng/ml。3、不同浓度的dcOC干预MG63细胞1小时,以剂量依赖的方式促进了Akt磷酸化,效应最显著的浓度是3ng/ml（P<0.01）,GPRC6A、HIF-1α、GLUT1和Runx2的表达水平没有显著改变。4、用不同浓度的dcOC干预MG63细胞72小时,dcOC增加了HIF-1α和GLUT1的蛋白表达水平,并以剂量依赖的方式提高了Akt的磷酸化水平,这种效应最有效浓度为10ng/ml（P<0.01）,GPRC6A的表达水平没有显著改变。5、CCK8法验证dcOC对MG63细胞增殖的作用。与对照组相比,不同浓度dcOC干预后,24小时、48小时和72小时的细胞的增殖能力均明显增加,且具有剂量依赖效应。在10ng/ml的浓度下,dcOC促进细胞增殖的作用最为明显（P<0.01）。6、ALP活性检测的结果提示与对照组相比,3ng/ml和10ng/ml的dcOC干预72小时后,ALP活性显著升高（P<0.01）。7、用LY294002抑制PI3K的活性,然后用3ng/ml dcOC溶液干预MG63细胞1小时,与dcOC组相比,dcOC增加Akt磷酸化水平和增加2-NBDG摄取的效应均被抑制（P<0.01）;但对GLUT1蛋白的表达水平没有影响（P>0.05）。8、用siRNA抑制MG63细胞的HIF-1α表达,以最适浓度的dcOC（10ng/ml）干预MG63细胞72小时,与dcOC组相比,dcOC增加2-NBDG摄取和增加GLUT1蛋白表达的效应也消失了（P<0.01）。9、小鼠腹腔注射dcOC8周后各组体重无统计学差异（P>0.05）;空腹血糖及空腹胰岛素水平无统计学差异（P>0.05）。10、小鼠腹腔注射dcOC8周后,各组小鼠血清钙磷水平无显著性差异（P>0.05）;与对照组相比,HOC组小鼠的血清P1NP水平可升高（P<0.05）,但血清OPG水平与对照组相比无显著性差异（P>0.05）。11、免疫组化检测结果明确表明,GPRC6A受体和GLUT1在小鼠成骨细胞中均有表达,不同浓度的dcOC干预对小鼠成骨细胞GPRC6A的蛋白表达水平没有影响（P>0.05）,30ng/g/d的dcOC的干预可提高GLUT1的蛋白表达水平（P<0.05）。12、在不同剂量的dcOC干预下,小鼠皮质骨密度、小梁骨密度、BV/TV、小梁厚度和小梁数均没有显著变化（P>0.05）。结论:1、在体外实验中,在没有胰岛素参与且环境葡萄糖水平正常的情况下,dcOC短期干预（1小时）通过激活PI3K/Akt信号通路来促进MG63细胞的葡萄糖摄取的,但不增加GLUT1的蛋白表达;长期干预（72小时）可以通过增加HIF-1α的表达来增加MG63细胞的GLUT1蛋白表达,进而促进MG63细胞的葡萄糖摄取。2、dcOC干预可以增加MG63细胞的增殖活力,ALP活性及细胞分化的能力。3、在体内实验中,腹腔注射重组dcOC（30ng/g/）8周,可能会影响小鼠成骨细胞的成骨活性,但对小鼠空腹血糖、胰岛素水平、骨密度和骨微结构没有影响。