第一部分 脊髓运动神经元的体外培养与鉴定 目的：探索脊髓运动神经元的分离、纯化及体外培养方法，寻找有效的鉴定途径，为ALS运动神经元变性、死亡影响因素的研究提供一种工具。 方法：取材于胚胎16天的SD大鼠的脊髓组织，先经胰酶消化，离解成单细胞悬液，以6.8％的Metrizamide密度梯度离心，收获离心介质上方的细胞即为脊髓运动神经元，然后差速贴壁，将所得细胞进一步纯化，最后以4×10~5／ml密度接种于24孔培养板，24小时后加入阿糖胞苷抑制非神经元细胞的分裂增殖，前两天采用L-15有血清培养基，48小时后改用无血清培养基，以后每隔两天半量换液一次。本实验应用ABC免疫细胞化学技术以胆碱乙酰转移酶(ChAT)多克隆抗体特异性标记脊髓运动神经元。 结果：ChAT阳性细胞即脊髓运动神经元占所培养细胞的85％以上，脊髓运动神经元不能分裂增殖，只能短暂培养，体外培养存活7～9天左右，结合应用有血清和无血清两种培养基最大程度地保证了运动神经元的纯度和存活时间。 结论：体外培养的脊髓运动神经元可以作为研究运动神经元损伤保护因素的理想模型，ChAT能够特异性标记脊髓运动神经元。 第二部分 脊髓运动神经元的形态学分析 目的：通过不同培养时间细胞的存活率和形态学特征了解体外培养的脊髓运动神经元的生长规律，选择施加干预因素及观测结果的最佳时间。 方法：在倒置显微镜(×250)下，计数培养0、1、3、5、7、9天细胞的存活数目，以第0天的细胞计数作为基数100％，其它组的计数除以第0天的细胞计数，以百分比表示该组的细胞存活率。在高倍镜视野(×400)下，利用图像分析系统测量户JJS体外实验模型的建立及脊髓运动神经元损伤保护因素的研究中文提要培养1、3、5、7、9天ChAT阳性细胞的轴突长度、树突数目、树突总长度、树突分叉点数目和胞体面积五个形态学指标。 结果:随时间的延长，脊髓运动神经元存活率呈下降趋势。第一天存活率为59%，第三到五天维持在50%左右，第七天缓慢下降至37%，九天以后，大部分细胞己经死亡。从形态学来看，无论是突起长度、突起数目还是胞体面积在前三天增长幅度最快，四到七天这段时间各项指标缓慢上升，生长稳定，七天后各项指标又快速下降，第九天神经元胞体萎缩，突起断裂，濒临死亡。 结论:原代培养的脊髓运动神经元的存活率、突起长度、分叉点数目和胞体面积等指标可以反映细胞的生长状况，培养三到五天时生长状态最佳，适宜于实验中各项指标的观测。第三部分还原型谷肤甘肤和L一NAME对体外培养的脊髓运动神经元的影响 目的:探讨氧化损伤是否参与了运动神经元的变性与死亡，还原型谷肤甘肤和L一NAME对培养的脊髓运动神经元有否保护作用。 方法:将脊髓运动神经元分成九个小组:对照组(不加入任何药物);0.1 mM、lmM、10mM、20mM4种不同浓度的GSH处理组;10一M、10一SM、104M、10一3M4种不同浓度的L一NAME处理组。接种后即给予以上药物，每隔12小时重复给药一次，三天后计数每组细胞存活数目，计算存活率。对GSH 10 mM和L一AME10一3M生长状态最好的两处理组培养三天后的免疫细胞化学标本进行图像分析，测量每组形态学指标。采用Stata 6.0软件对结果进行统计处理。 结果:GSH浓度在1 mM一1 omM之间时，随浓度升高，细胞存活率有所提高，1 omM的GSH细胞存活率最高，达到66%，当浓度高于1 OmM时，存活率反而下降。L一NAME在10一M一10一3M浓度范围内，神经元的存活率也有升高。从形态学角度看，两实验组只有树突数目与对照组比较差异无显著性(P>0.05)，其它各项指标均高于对照组，ALS体外实验模型的建立及脊髓运动神经元损伤保护因素的研究中文提要统计学有意义。 结论:抗氧化剂和NOS抑制剂可以提高脊髓运动神经元的存活率，促进神经元生长，提示氧化自由基加重了脊髓运动神经元的损伤，ALS运动神经元变性过程中可能存在氧化损伤。