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胃癌是全世界范围内常见的消化系统肿瘤之一,其死亡率一直居高不下。由于复杂的发病机制,且恶性病变程度对病人的身体健康造成了严重威胁,目前临床尚无针对其的早期特异性诊断和有效治疗方法。因此,开发新的早期诊断和治疗方法是目前的研究重点。在肿瘤研究中,应用生物信息学数据库,筛选与肿瘤发生发展相关的基因,可为临床对疾病诊断和新药开发提供新的科学依据。微小RNA(microRNA)作为一种小的非编码RNA参与肿瘤的发生发展,在许多进程中发挥重要作用,包括参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、分化等等。随着近年来对miRNA的深入研究,越来越多的研究结果表明,肿瘤中部分miRNA表达失调,可以通过扮演原癌基因或者抑癌基因的角色进一步参与调控肿瘤的发生发展。有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(MAD2L1)是有丝分裂检查点复合蛋白的重要组成部分,MAD2L1基因在人中位于4号染色体,在小鼠中位于6号染色体上。本研究利用生物信息学数据库分析发现,与正常组织相比,MAD2L1在胃癌组织中显著高表达;MAD2L1与miR-30a-3p表达显著负相关;miR-30a-3p可以和MAD2L1的3’-UTR区结合,推测MAD2L1与miR-30a-3p可能在胃癌的发病机制中扮演着非常重要的角色。miR-30a-3p属于miR-30家族的成员之一,长度为22 bp,在许多肿瘤中被报道参与调节增殖、凋亡、侵袭和迁移。本研究采用生物信息学方法从公共数据库中筛选出胃癌相关关键基因,从中选取周期靶基因MAD2L1,再通过分析选出和其表达显著负相关的miR-30a-3p,通过双荧光素酶报告基因实验、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白免疫印迹分析、细胞增殖能力检测(MTT)、流式细胞术检测细胞周期等细胞生物学和分子生物学实验检测方法,探究了MAD2L1与miR-30a-3p在胃癌中所发挥的作用以及它们之间的相互关系。方法:1.分别通过TCGA、GEO数据库分析在胃癌正常样本和肿瘤样本中差异表达的基因,两个数据库所得差异表达基因取交集再通过String网站分析、聚类差异表达基因,得到得分最高的一组作为胃癌相关关键基因,并将其GO聚类分析选出周期相关靶基因MAD2L1,进一步通过linkedomics网站联合TCGA数据库分析选出miR-30a-3p。2.合成miR-30a-3p成熟体模拟物(mimics),通过qRT-PCR实验检测miR-30a-3p-mimics在胃癌细胞AGS及BGC-823中的转染效率。通过Western blot检测miR-30a-3p在蛋白水平上对MAD2L1的影响;通过MTT实验、克隆形成实验和流式细胞术检测miR-30a-3p对胃癌细胞AGS及BGC-823增殖、周期的影响。3.合成MAD2L1的野生型和突变型双荧光报告载体,在HEK-293细胞中使用双荧光素酶素报告基因实验明确miR-30a-3p与MAD2L1之间的靶向关系。4.构建MAD2L1的过表达载体,在胃癌细胞AGS和BGC-823细胞中通过MTT实验和细胞周期实验检测共转染miR-30a-3p mmics和ov-MAD2L1后的细胞增殖能力、周期的变化情况。结果:1.联合TCGA数据库和GEO数据库,并通过STRING、聚类分析等分析结果,得到得分最高的一组基因KIF11、NCAPD2、TOP2A、MCM3、MCM2、KIF23和MAD2L1为胃癌的关键基因;在肿瘤中高表达的MAD2L1可能是胃癌的新标志基因;正常组织相比miR-30a-3p在胃癌组织中表达显著降低;MAD2L1与miR-30a-3p表达显著负相关。2.合成miR-30a-3p成熟体模拟物(mimics),qRT-PCR检测过表达miR-30a-3p在胃癌细胞AGS和BGC-823细胞中mRNA水平的表达情况,结果表明:两种细胞实验组miR-30a-3p的表达量显著高于对照组;MTT实验和克隆形成实验结果表明:与对照组相比过表达miR-30a-3p可以抑制AGS和BGC-823细胞的增殖能力;细胞周期实验结果表明:与对照组相比过表达miR-30a-3p可将细胞周期阻滞在G0/G1期。3.合成MAD2L1的野生型和突变型双荧光报告载体,在HEK293中采用双荧光素酶素报告基因实验,结果表明miR-30a-3p与MAD2L1具有良好的靶向关系;Western blot实验结果表明:与对照组相比过表达miR-30a-3p后MAD2L1的蛋白水平表达显著降低。4.通过MTT、细胞周期实验检测同时过表达miR-30a-3p和MAD2L1结果显示:过表达MAD2L1可以挽救单独过表达miR-30a-3p对AGS和BGC-823细胞的增殖能力的抑制作用和细胞周期的阻滞作用。结论:1.KIF11、NCAPD2、TOP2A、MCM3、MCM2、KIF23和MAD2L1可以做为胃癌的相关关键基因。2.miR-30a-3p在胃癌组织中表达显著降低,过表达miR-30a-3p可在蛋白水平抑制MAD2L1的表达,同时可以抑制胃癌细胞的增殖,并将细胞阻滞在G0/G1期。3.在模式细胞HEK-293中miR-30a-p可靶向调节MAD2L1表达。4.同时表达miR-30a-3p和MAD2L1可以挽救单独过表达miR-30a-3p对胃癌细胞增殖和周期的影响,进一步证明了miR-30a-3p与MAD2L1之间存在一定的靶向关系,从而影响胃癌细胞的增殖。