大多数食品蛋白因含丰富的谷氨酰胺残基,而导致其溶解度较低,低溶解度会影响乳化性、发泡性和凝胶性等功能性质,大大限制了在食品工业上的应用。蛋白质的脱酰胺作用被公认为提高溶解度的最有前景的途径,已经成为国内外研究的热点。蛋白质谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase, PG)是引起脱酰胺作用的一种新型水解酶,最早在金黄棒状杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)中发现,该酶可有效改善酪蛋白、小麦蛋白、米谷蛋白等食品蛋白的溶解度,提高乳化性、凝胶性等功能性质,在食品工业中具有十分广泛的应用前景。本课题利用基因工程技术,采用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌两种表达系统,对蛋白质谷氨酰胺酶进行重组表达,得到有生物学活性的PG酶,并对该酶进行性质研究,为今后PG酶的研究和开发提供了参考。本课题研究的主要内容包括以下三个方面：1、蛋白质谷氨酰胺酶基因的人工合成对PG全长基因序列进行优化,优化后设计成24条相互重叠的寡核苷酸片段,每条片段大约60bp,且重叠部分大约20bp。通过重叠延伸PCR反应将这24条寡核苷酸片段拼接起来,得到一条全长为982bp的PG全长基因。合成后将长片段克隆至pUC19-T载体上,进行序列分析,结果表明由Assembly PCR组装成的长片段基因在第724位碱基处多出一个胸腺嘧啶(T),发生了移码突变。再次设计两对引物,通过重叠延伸PCR对该序列进行定点诱变,经测序分析,获得了序列完全正确的PG全长基因。2、蛋白质谷氨酰胺酶在大肠杆菌表达系统中的表达与活性检测以pUC19-T-PG为模板,PCR扩增出PG成熟肽序列,克隆至原核表达载体pET32a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到基因工程菌。通过IPTG和乳糖自诱导两种方式表达重组蛋白,结果表明重组蛋白主要以包涵体形式表达,乳糖自诱导表达途径的蛋白产量是IPTG诱导的5.3倍。通过降低诱导温度和共表达分子伴侣两种策略,以期实现重组蛋白的可溶性表达,结果表明低温对可溶性的提高有一定的作用,而分子伴侣影响甚微。收集包涵体,经变性、复性后获得活性PG,通过Ni离子亲和层析对复性后的PG酶进行纯化。将纯化的PG酶与底物Cbz-Gln-Gly进行孵育反应,结果表明,PG可有效水解Cbz-Gln-Gly谷氨酰胺残基上的氨酰基,释放出氨；酶学性质的研究表明,PG酶的最适反应温度为40℃,最适作用pH为6.0。3、蛋白质谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌表达系统中的表达与活性检测在本章节中,构建了两种新型的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHPW和pCW。利用重叠延伸PCR技术将强启动子p43序列和中性蛋白酶信号肽nprB序列进行无缝连接,得到p43-nprB片段,将其克隆至pHP13中,得到穿梭载体pHPW。以pUC19-T-PG为模板,PCR扩增出PG成熟肽序列,克隆到pHPW中,得到重组表达载体pHPW-PG。再将pHPW-PG转化枯草芽孢杆菌DB403,获得基因工程菌pHPW-PG/DB403。发酵表达并提取PG粗酶,用SDS-PAGE检测PG酶的表达情况,结果表明,穿梭载体pHPW可有效将PG酶分泌于细胞外。用二肽Cbz-Gln-Gly溶液作为反应底物检测PG酶活性,表明PG粗酶可有效脱去二肽中谷氨酰胺残基的氨酰基,释放出氨；用小麦蛋白、酪蛋白和面筋作为酶解底物,结果显示PG粗酶能提高溶解度。本实验构建了另一种新型的穿梭载体——pCW,该载体带有低温诱导型启动子des和中温α淀粉酶信号肽SamyQ。将PG酶成熟肽基因克隆至穿梭载体pCW中,转化DB403,得到基因工程菌pCW-PG/DB403,在25℃环境条件下,发酵表达外源蛋白。经SDS-PAGE验证,得到了较为单一的蛋白条带,说明降低培养温度可抑制DB403自身蛋白的分泌,而启动子des依旧可以启动外源蛋白的分泌表达,证实pCW具有低温诱导的功能。提取PG粗酶,用二肽Cbz-Gln-Gly和酪蛋白溶液作为酶解底物,检测PG酶的活性,结果表明PG粗酶可有效脱去二肽中谷氨酰胺残基的氨酰基,释放出氨；酶解酪蛋白的实验表明PG粗酶可提高酪蛋白的溶解度。以上结果表明,本课题构建的两种新型穿梭载体pHPW和pCW,均具有分泌表达外源基因的功能。通过功能性实验,验证了这两种载体表达的PG酶均具有一定的生物学活性。pHPW和pCW的构建,为外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达提供了新的途径,尤其是低温诱导型载体pCW,更显示出一定的应用前景。本实验构建的两种基因工程菌pHPW-PG/DB403和pCW-PG/DB403,均能表达有活性的PG酶,为今后该酶的研究和开发提供了参考。