论文部分内容阅读
虽然前人有过相关人参组织培养的大量研究,然而,至今尚无建立完整的人参组织培养体系之报道,同时植物愈伤组织的形成、脱分化及再分化机理尚无明确的揭示。针对上述人参组培及植物组培机理研究中存在的问题,通过研究建立了诱导和增殖人参愈伤组织的较完善的体系,同时探讨并初步建立了人参再生植株诱导方法;采用RACE方法在人参中克隆了植物愈伤组织的形成、脱分化及再分化等组培过程中起关键作用的SERK基因的全长cDNA,并采用半定量RT-PCR方法研究了该基因在人参愈伤组织以及愈伤组织中发生的芽当中的表达特性。为建立人参组培完整体系及揭示植物组织培养机理等方面奠定了基础,同时也为今后的相关研究提供了参考,得到的结论如下:1)通过均匀设计法对对人参叶片愈伤组织诱导培养基进行了优化,得到的最佳培养基配方为:MS+2,4-D2mg/L+NAA0.66mg/L+KT1.0mg/L,诱导率达 93%。以最优激素组合为基准,保持其中两个激素含量不变,另外一个激素设定不同浓度梯度的方式来进行各激素的单因素诱导实验,结果表明:2,4-D是人参脱分化过程的必需激素,而NAA,KT则不是这一过程的必需激素,但后两种激素的存在有利于人参愈伤组织的生成,且KT的促进作用强于NAA。将人参根、茎、叶外殖体接种到添加有2mg/L 2,4-D、1mg/L KT、0.66mg/L NAA的MS培养基中进行愈伤组织诱导时,发现人参叶片的脱分化能力最好,茎段次之,根最差。2)通过探讨愈伤组织在附加不同激素的培养基上的生长情况,筛选出四个增殖率较高、增殖后愈伤组织质地较好的培养基,培养基组成如下:A2:MS+GA30.25mg/L+IBA0.75mg/L+6-BA1.25mg/L+NAA2.25mg/L+KT0.25 mg/L+2,4-D1mg/L;A4:MS+GA30.75mg/L+IBA1.75mg/L+NAA2.0mg/L+KT0.625 mg/L+2,4-D0.75mg/L;A7:MS+GA31.5mg/L+IBA0.5mg/L+6-BA2.25mg/L+NAA0.25mg/L+KT0.5mg/L+2,4-D0.375mg/L;A9:MS+GA32mg/L+IBA1.5mg/L+6-BA1mg/L+KT0.875mg/L+2,4-D0.125mg/L。3)愈伤组织的分化试验显示:6-BA及IBA配合使用时能够促进人参愈伤组织产生不定芽,且当添加3mg/L的6-BA及IBA时,出芽率较高,达13%;在添加有3mg/L6-BA,3mg/LIBA,3mg/LNAA的MS中能够诱导不定根发生,生根率为10%。4)采用RACE法克隆了一条全长2075bp的人参SERK基因,命名为pgSERK1。通过构建不同植物pgSERK1基因的系统发育树,发现人参pgSERK1基因与伞形科的胡萝卜中的SERK基因亲缘最近,其次与藜科菠菜和甜菜、菊科植物紫茎泽兰和北野菊的亲缘较近,与其它植物中SERK基因的亲缘性较远。5)用半定量RT-PCR的方法考察pgSERK1基因在人参组织培养中的表达情况时,意外发现了属于另一条SERK基因的片段pgSERK2,通过对两个基因的表达进行研究后发现,pgSERK1仅在初生愈伤组织、胚性愈伤组织阶段表达,在人参叶片及不定芽中不表达,而pgSERK2在人参叶片、愈伤组织、人参芽中均有表达,且在人参芽中的表达量显著高于其它阶段,据此推测,pgSERK1与人参愈伤组织形成及胚性获得有关,而pgSERK2的过量表达可能对人参愈伤组织不定芽发生有一定促进作用。