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近年来,随着宏基因组技术的出现和广泛使用,显著拓展了人们对环境微生物多样性的认识。宏基因组技术是指不经过微生物培养,直接提取环境微生物的总基因组的技术。使用该技术,对原本在环境中超过99%的不可培养微生物基因的操作和研究成为了现实,这促使人们发现了大量具有价值的新的蛋白和活性小分子物质。本课题研究采用宏基因组技术,针对来源于贵州铜仁梵净山的土壤微生物样本,构建了一个库容克隆数量达到5×104的宏基因组文库。基于三丁酸甘油酯水解生成透明圈的功能筛选方法,从文库中分离出新酯酶全长基因1条(命名为EstC23)。进化关系分析表明,该酶隶属于脂肪酶第Ⅳ家族(Hormo ne-sens itive lipase family, HSL)。对该基因的异源过表达研究表明,该基因在T7强启动子作用下,产生的可溶性蛋白占细胞总蛋白量的30%左右。纯酶蛋白的酶学性质表征显示,EstC23在25℃pH8.0条件下,对pNP-butyrat的酶活达254U mg1,该酶的最适反应温度为40℃,特别是在5-10℃低温下仍能维持最大活性的50%。EstC23在浓度达50%(v/v)的非极性有机溶剂(高logP)中显现出极强的稳定性,尤其在50%(v/v)的苯类和烷烃类有机溶剂中,其活力能提升至92%至274%之间,孵育一周后酶活性不会降低。同时,酯酶EstC23能水解叔醇酯底物,这是通常的酯酶或脂肪酶不具备的底物活性。这些结果表明,EstC23在酯合成、手性化合物的拆分、不稳定中间体化合物合成、肽合成等方面具有潜在应用价值。后续我们以EstC23核酸序列为基础设计特异性引物,基于宏基因组特异性PCR技术(Metagenomic Gene Specific PCR, MGS-PCR)和截断宏基因组特异性PCR技术(Truncated Metagenomic Gene Specific PCR, TMGS-PCR),对来自全国不同地域环境的65组宏基因组DNA进行序列筛选,分别获得了同源家族全长功能基因7条和核心片段15条,序列分析比对,这些基因及基因片段表现出了高度的序列多样性,其核酸相同百分比在50-97%之间,这些序列构成了一个新的酯酶基因亚家族。这为后续以酯酶亚家族为对象的功能研究,以及DNA-family-shuffling为方法的体外功能进化,提供了有价值的实验材料。