白灵菇碱提多糖的纯化及其抗癌活性的研究

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大多数真菌多糖具有抗肿瘤、参与免疫调节等作用,真菌多糖的研发也成为真菌研究领域的热点之一。本文以白灵菇为对象,在前人研究的基础上,探讨了白灵菇多糖的提取、分离纯化,进行了白灵菇多糖理化性质的研究,并对其基本结构进行了探讨,着重研究了白灵菇多糖对HepG-2肝癌细胞生存、生长的影响,初步探讨了其产生作用的机制。采用碱提法对白灵菇多糖进行提取,使粗多糖得率为5.14%;用琼脂糖凝胶柱层析进行分离纯化,得到4个组分:PNA-1、PNA-2、PNA-3及 PNA-4,测定出总多糖含量为84.17%,其中含有蛋白质3.70%。对其溶解性、粘度、热特性、结晶性等理化性质进行了研究,采用高效液相法测得PNA-2分子量为37 kDa; PNA-2的红外光谱分析出其为p-型多糖,含有吡喃键及呋喃键;采用气相色谱法对PNA-2的单糖组分进行分析,得出其单糖含有大量葡萄糖,有少量甘露糖、半乳糖,还有痕量核糖。以HepG-2肝癌细胞为研究对象,通过MTT法研究了白灵菇多糖对其增殖的抑制作用,确定试验组浓度为PNA-2的12.5μg/mL、62.5 μg/mL、125μg/mL;进行细胞划痕实验,得出PNA-2能够抑制HepG-2细胞的迁移;进行了扫描电镜观察细胞形态实验及AO/EB染色实验,结果显示,PNA-2能够诱导HepG-2细胞凋亡;彗星实验(单细胞凝胶电泳实验)表明:48 h后,PNA-2能对HepG-2细胞DNA造成显著损伤;流式细胞术检测细胞周期结果显示,PNA-2将HepG-2细胞阻滞在G0/G1期,并引起细胞凋亡。对PNA-2诱导HepG-2细胞凋亡的作用机制进行了初步探讨。罗丹明染色法检测其线粒体膜电位的变化,结果显示,PNA-2能明显破坏HepG-2细胞的线粒体膜电位;对HepG-2细胞促凋亡因子caspase-3、caspase-9、Cytochrome C及抑凋亡因子Bcl-2的表达结果表明,c aspase-3、caspase-9、Cytochrome C的表达显著上升,而Bcl-2表达下降。从而初步得出结论:PNA-2通过线粒体途径诱导HepG-2细胞凋亡,进而抑制了其生长。
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