仿生固定化酶制备及其催化特性研究

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载体理性设计和制备是固定化酶领域的研究热点和前沿。本文借鉴酶在生物体中的存在形式,模仿细胞的多层结构,通过成分仿生、功能仿生和过程仿生设计和制备了核壳结构微囊,用于包埋β-D-葡萄糖醛酸苷酶(GUS),催化天然成分黄芩苷的高值转化。通过系统考察微囊液核、壳膜和杂化壳壁的结构和制备条件对GUS活力和稳定性的影响,尝试提出仿生固定化酶载体的制备原则。首先,模仿细胞液的成分和功能选用三种具有不同电性的多糖(羧甲基纤维素钠、甲基纤维素和羧甲基壳聚糖钠)作为仿生微囊的液核,经比较可知,与酶分子具有静电排斥作用的多糖更有利于酶构象、活力的维持和酶稳定性的提高;然后,模仿细胞膜的结构和功能构建仿生微囊的壳膜。在适宜的制备条件下,多孔的海藻酸钙壳膜可在保证底物和产物自由扩散的同时,有效防止酶的泄漏;模仿硅藻细胞壁的形成过程和功能,首次利用精蛋白调控微囊表面的仿生硅化,形成规整的精蛋白/氧化硅杂化壳壁,完全抑制了微囊的溶胀,有效提高了微囊的重复使用稳定性。此外,还首次研究了精蛋白在仿生硅化过程中的催化作用和模板作用,并对仿生硅化的机理进行了初步探讨。最终确定以羧甲基纤维素钠为仿生微囊的液核,制备出具有海藻酸/精蛋白壳膜和精蛋白/氧化硅杂化壳壁的微囊(APSi微囊),并用于包埋GUS,催化黄芩苷转化为黄芩素。其中羧甲基纤维素钠液核能够模仿GUS在生物体中的负电环境,提高GUS的活力和稳定性,尤其是在酸性条件下的pH稳定性和储存稳定性;海藻酸/精蛋白壳膜和精蛋白/氧化硅壳壁可实现GUS的高效包埋,防止GUS泄漏,同时提高了固定化GUS在碱性条件下的pH稳定性和重复使用稳定性。GUS在APSi微囊中的包埋率为69%,酶活力表现率为125%;在极端pH条件下,固定化GUS仍能维持85%以上的相对酶活力;储存26天后固定化GUS的相对酶活力仍高于90%;重复使用10次,固定化GUS的酶活力仍无明显下降;在37℃和pH7.0的条件下利用APSi微囊固定化的GUS水解黄芩苷,所得黄芩素的产率高达73%。
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