研究背景冷静等曾对上海市1582名40岁以上男性进行研究，发现勃起功能障碍(ED)的患病率为73.1％。流行病学调查发现大多数男性45岁以后患ED的风险性明显增高，当前在全世界约有15200万男性正遭受到ED的困扰，仅仅美国就有3000万人，据推测，到2025年全世界将有32200万人会经历ED。所以ED作为一种危害人们生活质量的疾病，已经引起了广泛的重视。而勃起功能障碍的男性患者中有35％～75％是糖尿病患者，而糖尿病是一组代谢性临床综合征，全球已确诊的有1.5亿人，预测2025年将增至3亿。因此，糖尿病性ED已成为男科学学者研究的热点。1实验动物的选择医学研究常常需要使用动物模型作为实验假说和临床假说的实验基础，男科学的相关研究，如ED更是如此，因为在人类身上直接进行的男科学相关研究会受到多种因素的限制，如伦理道德、组织取材的限制、不易控制共同背景受试条件等，因此男科学学者们设计了各种ED的动物模型用于ED的生理、病理生理、药理学等各方面的研究。为了保证动物实验的结果外推到人类这一最终过程的合理性及有效性，选用恰当的动物经行模型的构建是研究者首先应该考虑的问题。灵长类动物，如猴、大猩猩等是研究ED最好的动物，与人的实际情况也最为接近，但由于价格昂贵、动物缺乏、和伦理道德等的限制，国内尚无用灵长类动物经行研究的报道。大鼠是ED研究中应用最多的动物，其价格也是比较合适的，是用于ED研究中最便宜的，而且大鼠在盆腔、阴茎的血管和神经的解剖、受体的分布，性反应的感觉反射等方面都和人有较为一致的相似性，因此绝大多数的ED研究都可以用大鼠作为实验动物。因此，本研究所选动物为大鼠。2阴茎组织解剖学结构及勃起机制阴茎是由一对阴茎海绵体和一个尿道海绵体所形成的圆柱形器官，其中尿道海绵体包绕尿道，并形成远端的阴茎头。每个海绵体周围均有纤维鞘膜包绕，但两个阴茎海绵体间存在许多间隙，以利于海绵体间的血液交通。阴茎海绵体由平滑肌及纤维成分组成的小梁构成，小梁间有许多相互沟通的窦间隙，由内皮细胞衬附。阴茎的勃起是由于在多种因素作用下阴茎海绵体平滑肌松弛而引起。阴茎海绵体平滑肌的舒张使血流不断流入阴茎海绵窦，海绵窦间隙扩大，阴茎肿胀，白膜受压，导致沟通海绵窦与阴茎背静脉的沟通静脉受压，限制了阴茎海绵体内的血流流出，使血管内回流阻力上升，以至于静脉血不能外流，阴茎内血压上升，产生了坚硬的勃起。这种机制被称为静脉闭塞机制(Corporal Venooclusive mechanism)。而阴茎的疲软则是由阴茎海绵体平滑肌紧张收缩的结果，交感神经的兴奋使得平滑肌收缩，导致了动脉供血的减少，窦间隙缩小，海绵体内血压下降，白膜压迫减小，海绵窦静脉血外流增加，从而引起阴茎的疲软。3阴茎海绵体平滑肌表型转化的研究在正常人阴茎海绵体组织中平滑肌约占40％—52％，其余主要为胶原纤维。平滑肌主要分布在白膜下。研究表明，对于静脉闭塞机制障碍引起的勃起功能障碍的患者，阴茎海绵体平滑肌为19％—36％，而动脉供血不足引起勃起功能障碍的患者，阴茎海绵体平滑肌占10％—25％，并且随着年龄的增长，平滑肌的比例会进一步减少，因此可见，阴茎海绵体平滑肌是海绵窦间隙舒张及阴茎勃起的结构基础，当其功能及数量发生改变时，正常的勃起功能将会受到影响。近年来，对于心血管平滑肌在心血管疾病中所起的重要作用研究较多且深入，尤其是心血管平滑肌表型转化的研究，平滑肌的表型转化是指：机体发育的不同阶段或不同疾病状态下所发生的形态、结构和功能的改变。应当区别于化生的概念，化生是指：在病理状态或外界刺激作用下，同一胚胎来源的成熟组织细胞，可以一种向另一种成熟的细胞化生，如长期吸烟的人，气管的纤毛柱状上皮化生为复层鳞状上皮。而阴茎海绵体组织被认为是一种特殊的血管组织，其小梁中的平滑肌与心血管平滑肌在功能上具有相似性，因此阴茎海绵体平滑肌是否同样具有表型转化的特性，相关研究未见报道。所以，本研究的目的在于了解阴茎海绵体平滑肌是否存在表型转化，以及表型转化对勃起功能的影响。4白膜中弹性纤维改变对勃起功能的影响白膜的弹性功能是由于白膜中有显著的弹性纤维的分布，正是这种分布，使其能够在呈波浪状的胶原纤维中起到牵拉的作用，从而使白膜在勃起过程中抵抗强大的海绵窦内压，并且压迫白膜下及穿透白膜的流出静脉，维持较高的窦内压。从另一个角度说，如果白膜过度扩张，将会引起海绵体内的血管、神经受到过度拉伸，从而引起血流动力学的障碍。如果白膜中弹性纤维含量减少，将会引起白膜整体结构回弹能力的下降，从而降低了在对白膜下及穿越白膜的流出静脉的压迫，会出现阴茎勃起静脉闭塞机制的异常。5阿朴吗啡(APO)在男科学中的应用APO(apomorphine)是一种生物碱，是将吗啡分子上加以改变的半人工合成品，麻醉效果大为降低，而对中枢神经系统的兴奋作用有所加强。对位于延脑最后区的呕吐化学感受区的刺激作用特别显著，因此，其最主要的临床作用是催吐。但是，当大鼠给予每kg体重30μg时，可以显著增强阴茎的勃起。大鼠在正常情况下是很少出现自发的勃起的，但给予注射微量的APO后，会出现阴茎勃起、欠身、打哈欠(PE／SYS)的典型表现，一般从注射后10分钟开始，持续20～30分钟。因此，利用注射APO这种物质，可以将判断是否存在ED，被认为是一种行之有效的判定ED及其程度方法。目的1．探讨糖尿病性ED大鼠模型的建立：①APO致大鼠阴茎勃起的研究；②探讨APO致大鼠阴茎勃起及空腹血糖正常值的范围；③探讨利用链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病性ED大鼠模型。2．对不同月龄大鼠阴茎组织形态学结构进行研究。3．探讨糖尿病性勃起功能障碍大鼠是否存在阴茎海绵体平滑肌表型转化，以及表型转化对勃起功能的影响。4．探讨糖尿病大鼠白膜中弹性纤维改变，以及对勃起功能的影响。5．探讨糖尿病对大鼠生精功能的影响。方法1．阿朴吗啡致大鼠阴茎勃起的研究：2月龄SD大鼠15只，在不同的5天，同一时间段内(早上9—11点)15只大鼠均给予相应处理，即第一天不给予注射APO观察勃起情况，第二天颈项皮肤松软处皮下注射APO60μg／kg观察勃起情况，第三天颈项皮肤松软处皮下注射APO80μg／kg观察勃起情况，第四天颈项皮肤松软处皮下注射APO100μg／kg观察勃起情况，第五天颈项皮肤松软处皮下注射APO120μg／kg观察勃起情况。记录并观察前30分钟内及后30分钟内的勃起次数。以龟头充血及阴茎体增长为阴茎勃起1次。2．探讨阿朴吗啡致大鼠阴茎勃起及空腹血糖正常值范围：APO 4mg溶解于0.5mg／kg的维生素C及生理盐水中，配制成浓度为40μg／ml的溶液，将30只大鼠全部按体质量注射100μg／kg的APO溶液，观察30分钟内的勃起次数，以龟头充血及阴茎体增长为阴茎勃起1次。并在大鼠空腹(大鼠禁食12小时)状态下取鼠尾血，利用血糖仪及配套血糖试纸测定空腹血糖。3．糖尿病勃起功能障碍大鼠模型的建立：30只SD大鼠，随机分为5组，分别为对照组、注射STZ40 mg／kg组、注射STZ60 mg／kg组、注射STZ80 mg／kg组、注射STZ100 mg／kg组，每组6只，分别记录4d、1周、2周、3周的空腹血糖、阿朴吗啡(APO)诱导阴茎的勃起次数及体质量。4．不同月龄大鼠阴茎组织形态学研究：不同月龄的SD大鼠，1月龄、2月龄、3月龄、4月龄各5只，麻醉后取阴茎组织，石蜡包埋并切片后，进行常规H.E染色，利用图像采集系统进行摄片，最后对采集的图片进行形态学描述。5．糖尿病勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体平滑肌表型转化的研究：利用链脲佐菌素(STZ)制作糖尿病及糖尿病性勃起功能障碍模型，在大鼠注射STZ后两周，血糖＞7.2 mmol／L及APO诱导未出现阴茎勃起的，可以认为是糖尿病性勃起功能障碍模型(DM&ED group)，归为DM&ED组；血糖＞7.2 mmol／L但APO诱导出现阴茎勃起的大鼠，被认为是糖尿病性非勃起功能障碍模型(DM group)，应归为DM组，如果此后该组中有大鼠APO实验未出现勃起，该大鼠将从DM组中剔除，注射STZ后，未出现血糖升高且勃起功能正常的归为未成模组(None group)。40只SPF级SD雄性大鼠，先按时间随机分为两组(每组20只)，分别是注射STZ后7周组和4周组，再按处理因素即给予大鼠腹腔注射STZ(60mg／kg)是否成模，分为对照组(未注射STZ，5只)、成糖尿病性勃起功能障碍模型组、成糖尿病性非勃起功能障碍组、未成模组。根据α-actin是血管平滑肌表型转化过程中的收缩型的敏感标志，骨桥蛋白(OPN)是合成型的标志，其表达的改变将标志着细胞由收缩型向合成型转化。利用结蛋白(Desmin)的表达的改变间接反应平滑肌细胞数目的改变。利用免疫组化SP染色法对不同处理组的标本进行α-actin的研究，利用免疫组化SABC染色法对不同处理组的标本进行Desmin的研究，利用原位杂交技术检测不同组别OPN mRNA含量的改变。图像分析利用彩色图文分析系统，第三人进行图像分析及数据采集，测量随机每高倍镜视野下累积光密度(IOD)，以IOD的值反映组织切片中相应阳性物质的表达程度。6．糖尿病性大鼠白膜弹性纤维成分改变对勃起功能的影响：将上述第5项的阴茎组织切片，利用维多利亚蓝—丽春红染色法对不同处理组的标本进行弹性纤维的染色，利用彩色图文分析系统，第三人进行图像分析及数据采集，测量随机每高倍镜视野下染成蓝绿色的弹性纤维累积光密度(IOD)，以IOD的值反映组织切片中弹性纤维的含量。7．糖尿病对大鼠生精功能的影响：将上述第5项大鼠，按照实验要求，将大鼠麻醉后取出睾丸，4％多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋，并连续切片，厚度5μm，进行常规H.E染色，利用图像采集系统进行摄片，最后对采集的图片进行形态学描述。结果：1．阿朴吗啡致大鼠阴茎勃起的研究：APO大鼠颈项部皮下注射后，前30分钟内勃起次数比后30分钟内的勃起次数显著较高(F=192.651，P=0.000)。对照组比其余各组的勃起次数均显著减少(P均小于0.001)。注射APO60μg／kg组与注射APO80μg／kg组间(P=0.336)及注射APO100μg／kg组与注射APO120μg／kg组间的勃起次数均无显著性差异(P=0.872)。注射APO60μg／kg组的勃起次数比注射APO100μg／kg组和注射APO120μg／kg组间的勃起次数均明显减少(P均小于0.05)。2．探讨阿朴吗啡致大鼠阴茎勃起及空腹血糖正常值范围：空腹血糖的95％正常参考值范围是4.0—7.2 mmol／L。APO给予大鼠皮下注射后，所有大鼠均出现勃起，在注射APO后的半小时内，最少勃起为1次，最多勃起为5次。3．糖尿病勃起功能障碍大鼠模型的建立：注射STZ后，4d、1周、2周、3周四个时间点间的空腹血糖有显著性差异(F=7.297，P=0.002)，第4d与第1、2、3周都有差异(O值分别是0.033，0.001，0.000)，且以第4d的空腹血糖较高，余两两间无显著性差异。不同组别间的空腹血糖存在显著性差异(F=16.508，P=0.000)，APO阴茎勃起实验的勃起次数在四个时间点间不存在显著性差异(F=1.236，P=0.306)，不同组别间的勃起次数不存在显著性差异(F=2.676，P=0.065)。体质量的改变在不回时间点间无显著性差异(F=0.584，P=0.628)。不同组别间的体质量改变有显著性差异(F=17.152，P=0.000)。4．不同月龄大鼠阴茎组织形态学研究：正常1月龄大鼠阴茎组织结构与其它组间有较大差异，1月龄大鼠阴茎海绵体只是含有一个圆柱状的海绵体柱，而且其中血窦小梁稀少，小梁中的平滑肌结构不是很清晰，且数量较少。其余3组间阴茎组织结构未见明显差别，阴茎海绵体有两个类圆柱型的海绵体构成，但两个海绵体间缺少明显的白膜间隔。5．α-actin免疫组化染色各处理组间IOD存在显著性差异(F=12.937，P=0.000)，糖尿病性勃起功能障碍组IOD均小于对照组、糖尿病非勃起功能障碍组及未成模组(P＜0.05)，糖尿病非勃起功能障碍组的IOD小于对照组和未成模组(P＜0.05)，不同时间点间的IOD不存在显著性差异(F=0.608，P=0.442)，交互效应不显著(F=2.130，P=0.120)。Desmin免疫组化染色不同时间点间的IOD不存在显著性差异(F=0.052，P=0.821)，各处理组间的IOD不存在显著性差异(F=0.045，P=0.987)，交互效应不显著(F=0.572，P=0.639)。OPN mRNA原位杂交染色不同时间点间的IOD不存在显著性差异(F=0.984，P=0.330)，各处理组间的IOD存在显著性差异(F=51.648，P=0.000)，交互效应不显著(F=0.246，P=0.864)。糖尿病性勃起功能障碍组的IOD均大于其余三组(P均小于0.001)。糖尿病非勃起功能障碍组的IOD大于对照组和未成模组(P均小于0.001)。对照组的IOD与未成模组未见显著差异(P=0.739)6．糖尿病性大鼠白膜弹性纤维成分改变对勃起功能的影响：各处理组间(即对照组，糖尿病性勃起功能障碍组，糖尿病非勃起功能障碍组，未成模组)白膜弹性纤维的含量存在显著性差异(F=10.433，P=0.000)，糖尿病性勃起功能障碍组均小于对照组、糖尿病非勃起功能障碍组及未成模组(P＜0.05)，糖尿病非勃起功能障碍组小于对照组(P＜0.05)，不同时间点间不存在显著性差异(F=0.685，P=0.415)，不存在交互效应(F=0.905，P=0.452)。7．糖尿病对大鼠生精功能的影响：对照组及未成模组大鼠睾丸生精上皮规则，排列紧密，结构清晰，层次分明，精原细胞增殖正常，规则地紧贴生精小管的基底膜，向内依次为初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子，组成多种形态的生精上皮图像。糖尿病性勃起功能障碍组和糖尿病非勃起功能障碍组睾丸生精小管内，各级生精细胞排列紊乱，形成不规则的空隙，以精原细胞为主，可见少量的精母细胞、精子细胞和成熟的精子：严重者生精小管内生精细胞排列疏松，细胞层数减少，细胞形态不一，出现大量胞体增大的精原细胞，胞膜不清，核不规则，并出现多个核碎裂小体。睾丸生精上皮变薄、生精细胞脱落，睾丸内出现了多个核碎裂小体，生精功能定会受到严重的影响。结论：1．APO诱导大鼠勃起的最佳剂量应为100μg／kg，最佳观察时间应为注射APO之后的30分钟。2．APO只要能诱导大鼠勃起即可以认为勃起功能正常，空腹血糖超过7.2mmol／L即可以认为是高血糖。3．最佳成糖尿病模型的STZ注射剂量应为60 mg／kg，筛选糖尿病ED模型的APO勃起实验筛选时间应定在注射STZ后的2周左右。4．大鼠阴茎组织是发育变化的，与人类的阴茎组织存在一定的差异。5．阴茎海绵体平滑肌在收缩成分上与心血管平滑肌有相似性；糖尿病可以引起阴茎海绵体平滑肌的表型转化；阴茎海绵体平滑肌表型转化可以导致勃起功能障碍。6．糖尿病可以导致白膜弹性纤维的减少；白膜中的弹性纤维在勃起过程起到重要作用；白膜中弹性纤维的减少将导致勃起功能障碍。7．糖尿病对大鼠的生精组织有着明显的破坏作用，对大鼠的生精功能有严重的影响。