第一部分 跑步锻炼和氟西汀对CUS抑郁症模型小鼠抑郁样行为的作用目的:重度抑郁症(MDD)是一种慢性、复发性精神疾病,对全世界数以亿计的人群产生影响。虽然在过去的40年里,选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)系统建立了情绪障碍与药物疗法间的有效连接,但从目前的临床治疗来看,15%到30%的病人对多个干预见效缓慢甚至在用药初期更加严重。若能找到先于经典抗抑郁药物起效的其他治疗手段,加快缓解抑郁情绪,从而减少患者的痛苦及降低治疗初始阶段的致残、致死率,具有重要的临床意义。方法:选取4-6周龄,体总约为10g左右的雄性C57BL/6J小鼠,适应性喂养和糖水偏好基线调整共2周后,淘汰10只无糖水偏好小鼠,并将剩余133只小鼠随机分为正常对照组(Control group,n=14)、模型组(n=119)。对模型组小鼠进行为期4周的CUS干预后根据糖水偏好结果筛选出成模小鼠42只,随机分为CUS模型对照组(CUS group,n=14)CUS干预+跑步组(CUS+RN group,n=14)以及CUS干预+氟西汀组(CUS+FLX group,n=14)。给予CUS+RN组小鼠为期4周的跑步锻炼干预:每天10 min,每周5天;第一周起始速度为5 m/min,第二周跑步速度为8 m/min,接下来2周的跑步速度均为10 m/min。给予CUS+FLX组小鼠为期4周的腹腔注射氟西汀治疗,药物剂量为10 mg/kg/d。对照组小鼠除行为学测试外,均为5只/笼;CUS组、CUS+RN组以及CUS+FLX组小鼠为孤笼喂养模式。每周同一时间称取各组小鼠的体质量,并对各组小鼠进行糖水偏好测试。干预结束后对各组小鼠进行旷场测试、悬尾测试以及强迫游泳测试。结果:(1)体质量:经过4周的CUS干预后,CUS模型组小鼠的体质量均显著性低于Control组小鼠(p<0.01);经过4周的跑步锻炼和氟西汀干预后,CUS组小鼠、CUS+RN组小鼠及CUS+FLX组小鼠的体质量均显著低于Control组小鼠(p<0.01),而CUS组小鼠、CUS+RN组小鼠及CUS+FLX组小鼠之间的体质量无显著性差异。(2)糖水偏好测试:经过4周的CUS干预后,CUS模型组小鼠的糖水偏好百分比显著性低于Control组小鼠(p<0.01)。在跑步锻炼和氟西汀干预至第3周时,CUS组小鼠的糖水偏好百分比显著性低于6Control组小鼠(p<0.01)。3周的跑步锻炼可以显著的改善抑郁模型小鼠的糖水偏好百分比(CUS+RN组vs.CUS组,p<0.01),而CUS+FLX组的糖水偏好百分比与CUS组小鼠的糖水偏好百分比无显著性差异(p>0.05)。当干预至第4周时,跑步锻炼和氟西汀均可以显著性改善CUS小鼠的糖水偏好百分比(CUS+RN组vs.CUS组,p<0.05;CUS+FLX组vs.CUS组,p<0.05)。(3)强迫游泳测试:在跑步锻炼和氟西汀干预4周后,CUS组小鼠的强迫游泳不动时间显著性长于Control组小鼠(p<0.05)。跑步锻炼可以显著改善抑郁样小鼠的强迫游泳不动时间(CUS+RN组vs.CUS组,p<0.01),而CUS+FLX组小鼠与CUS组小鼠的强迫游泳不动时间相比无显著性差异(p>0.05)。(4)悬尾测试:在跑步锻炼和氟西汀干预4周后,CUS组小鼠的悬尾测试不动时间显著性高于Control组小鼠(p<0.01)。而跑步锻炼和氟西汀均能显著性减少模型组小鼠的悬尾测试的不动时间(CUS+RN组vs.CUS组,p<0.01;CUS+FLX组vs.CUS组,p<0.01)。(5)旷场试验结果:Control组、CUS组、CUS+RN组和CUS+FLX组四组小鼠的旷场试验总评分均无显著性差异(p>0.05)。结论:1、干预至第3周时,跑步锻炼可以显著改善CUS抑郁症模型小鼠的抑郁样行为,而氟西汀则不能;干预至第4周时,跑步锻炼和氟西汀虽都可以改善CUS模型小鼠的糖水偏好和减少悬尾测试不动时间,但只有跑步锻炼能同时减少CUS模型小鼠的强迫游泳不动时间,提示跑步锻炼能够比氟西汀更快更全面地改善CUS诱导的抑郁症模型小鼠的抑郁样行为。2、本研究中CUS抑郁症模型小鼠不伴有焦虑样行为的改变。第二部分 跑步锻炼和氟西汀对CUS抑郁症模型小鼠海马内少突胶质细胞分化成熟和髓鞘形成的影响目的:跑步锻炼可以先于氟西汀改善抑郁症模型小鼠的抑郁样症状,但其作用的细胞机制尚不明确。本团队前期研究发现,跑步锻炼可以显著增加抑郁症模型大鼠海马内的成熟少突胶质细胞数量,而氟西汀不能改善其海马内的有髓神经纤维。本研究主要探讨跑步锻炼和氟西汀是否是通过促进CUS抑郁症模型小鼠海马内少突胶质细胞的分化成熟和髓鞘形成从而先于氟西汀起效的,为跑步锻炼的抗抑郁作用提供重要的基础研究证据。方法:行为学检测结束后,每组随机选取5只小鼠,麻醉后给予4%多聚甲醛经心脏灌注固定,分离出大脑组织。每只小鼠随机抽取一侧大脑半球,于梯度浓度的蔗糖水脱水,OCT包埋剂包埋后运用冰冻切片机沿冠状面切取50mm厚的连续切片,按照1/5的体视学抽样分数对含有海马结构的组织进行等距随机抽样,最终获得5组含有海马结构的连续等距切片。随机抽取两组连续等距切片分别进行PDGFRa+细胞(少突胶质前体)及CC1+细胞(成熟少突胶质细胞)的免疫组织化学染色,运用光学分合法分别对海马CA1、CA3和DG区内的PDGFRa+及CC1+细胞进行计数。从余下的三组等距切片中,按1/2的抽样分数再次抽样,分别进行Olig2+/PDGFRa+双标、CC1+/Brd U+/Olig2+三标和MBP的免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜拍照后分别计数各组小鼠海马CA1、CA3和DG区单位面积内Olig2+/PDGFRa+(少突胶质细胞系细胞)、Brd U+/Olig2+(分化期少突胶质细胞)及CC1+/Brd U+/Olig2+(新生成熟的少突胶质细胞)的细胞数量,以及海马内MBP的荧光强度值。然后,从第一部分的小鼠中每组再随机选取5只进行麻醉、灌注,戊二醛固定后取出大脑制成等距1 mm连续切片,随机抽取一侧大脑半球,在大脑等距连续切片的海马CA1内随机取6个大小约1 mm3的海马组织块,运用透射电镜技术测量四组小鼠海马CA1区内有髓神经纤维的g-ratio值。结果:(1)四组小鼠海马CA1、CA3和DG区内CC1+细胞的体视学计数结果:在CA1区内,CUS组小鼠CC1+细胞总数目较对照组小鼠显著性下降(p<0.05),跑步锻炼和氟西汀干预治疗后,CUS+RN组小鼠的CC1+细胞的总数目则较CUS组小鼠显著性增加(p<0.05),而CUS+FLX组小鼠的CC1+细胞的总数目则较CUS组小鼠无显著性差异(p(29)0.05)。在CA3区内,Control组、CUS组、CUS+RN组和CUS+FLX组四组小鼠的CC1+细胞数量均无显著性差异(p(29)0.05)。在DG区内,Control组、CUS组、CUS+RN组和CUS+FLX组四组小鼠的CC1+细胞数量也均无显著性差异(p(29)0.05)。(2)四组小鼠海马CA1、CA3和DG区内PDGFRa+细胞的体视学计数结果:在CA1区内,CUS组小鼠PDGFRa+细胞总数目较Control组小鼠显著性增加(p<0.05),跑步锻炼和氟西汀干预治疗后,CUS+RN组小鼠和CUS+FLX组小鼠的PDGFRa+细胞的总数目较CUS组小鼠均显著性减少(p<0.05,p<0.05)。在CA3区内,CUS组小鼠PDGFRa+细胞总数目较对照组小鼠显著性增加(p<0.05),而在跑步锻炼和氟西汀干预治疗后,CUS+RN组小鼠和CUS+FLX组小鼠的PDGFRa+细胞的总数目较CUS组小鼠均无显著性差异(p(29)0.05,p(29)0.05)。在DG区内,CUS组小鼠PDGFRa+细胞总数目较对照组小鼠显著性增加(p<0.05),跑步锻炼和氟西汀干预治疗后,CUS+RN组小鼠和CUS+FLX组小鼠的PDGFRa+细胞的总数目较CUS组小鼠均显著性减少(p<0.05,p<0.05)。(3)四组小鼠海马CA1、CA3和DG区内CC1+/Brd U+/Olig2+细胞的计数结果:在CA1、CA3区和DG内,CUS组小鼠Brd U+/Olig2+和CC1+/Brd U+/Olig2+单位面积内细胞数目较对照组小鼠显著性下降(p<0.05,p<0.05),跑步锻炼和氟西汀干预治疗后,CUS+RN组小鼠的Brd U+/Olig2+和CC1+/Brd U+/Olig2+单位面积细胞数目较CUS组小鼠显著性增加(p<0.05,p<0.05),而CUS+FLX组小鼠的Brd U+/Olig2+和CC1+/Brd U+/Olig2+单位面积细胞数目与CUS组小鼠无显著性差异(p(29)0.05,p(29)0.05)。(4)四组小鼠海马CA1、CA3和DG区内PDGFRa+/Olig2+细胞的计数结果:在CA1区内,CUS组小鼠单位面积内PDGFRa+/Olig2+细胞数目较Control组小鼠显著性升高(p<0.05),跑步锻炼和氟西汀干预治疗后,CUS+RN组小鼠和CUS+FLX组小鼠单位面积内的PDGFRa+/Olig2+细胞数目较CUS组小鼠均显著性减少(p<0.05,p<0.05)。在CA3区内,Control组、CUS组、CUS+RN组和CUS+FLX组四组小鼠的PDGFRa+/Olig2+单位面积细胞数目均无显著性差异(p(29)0.05)。在DG区内,CUS组小鼠PDGFRa+/Olig2+单位面积细胞数目较Control组小鼠显著性升高(p<0.05),跑步锻炼和氟西汀干预治疗后,CUS+RN组小鼠和CUS+FLX组小鼠的PDGFRa+/Olig2+单位面积细胞数目较CUS组小鼠均显著性减少(p<0.05,p<0.05)。(5)四组小鼠海马CA1、CA3和DG区内MBP+髓鞘形成蛋白纤维免疫荧光强度定量结果:在CA1区内,CUS组小鼠MBP+髓鞘形成蛋白纤维免疫荧光强度较对照组小鼠显著性下降(p<0.05),跑步锻炼和氟西汀干预治疗后,CUS+RN组小鼠的MBP+蛋白免疫荧光强度和纤维分布较CUS组小鼠显著性增加(p<0.05),而CUS+FLX组小鼠的MBP+有髓纤维分布面积百分比较CUS组小鼠无显著性差异(p(29)0.05)。在CA3区和DG区内,Control组、CUS组、CUS+RN组和CUS+FLX组四组小鼠的MBP+有髓纤维分布面积百分比均无显著性差异(p(29)0.05,p(29)0.05)。(6)四组小鼠海马CA1区内透射电镜计数有髓神经纤维的g-ratio值结果:在CA1区内,CUS组小鼠有髓神经纤维的g-ratio值Control组小鼠显著性升高(p<0.05),跑步锻炼和氟西汀干预治疗后,CUS+RN组小鼠的有髓神经纤维的g-ratio值较CUS组小鼠显著性增加(p<0.05),而CUS+FLX组小鼠的有髓神经纤维的g-ratio值较CUS组小鼠无显著性差异(p(29)0.05)。结论:1、CUS抑郁症模型小鼠海马CA1区和DG内OPC的分化成熟出现障碍,且髓鞘形成能力下降。2、4周的跑步锻炼可能是通过促进抑郁症模型小鼠海马CA1区和DG内少突胶质细胞的分化成熟及髓鞘形成来减轻抑郁症模型小鼠的抑郁样症状,而4周的氟西汀干预不能促进抑郁症模型小鼠海马内少突胶质细胞的分化成熟和髓鞘形成。3、跑步锻炼对海马内少突胶质细胞系的积极作用可能是其先于且优于氟西汀起效的重要细胞机制之一。第三部分跑步锻炼通过调节海马内PGC-1α促进少突胶质细胞分化成熟从而改善小鼠的抑郁样症状目的:以上研究发现跑步锻炼可以促进抑郁症模型小鼠海马内少突胶质细胞的分化从而改善抑郁样症状。有研究发现跑步锻炼可以增加海马内PGC-1α的含量,还有证据显示PGC-1α可以促进少突胶质细胞的增殖和分化。该部分主要探讨跑步锻炼是否通过海马内PGC-1α通路促进少突胶质细胞分化成熟从而改善小鼠的抑郁样症状,为跑步锻炼的抗抑郁作用提供科学依据。方法:选取4-6周龄的雄性C57BL/6J小鼠70只,适应性喂养1周后,随机分为空病毒对照组(AAV-GFP,n=16)、PGC-1α沉默组(AAVPGC-1α,n=16)、空病毒+跑步锻炼组(AAV-GFP+RN,n=16)和PGC-1α沉默+跑步锻炼组(AAV-PGC-1α+RN,n=17)。对四组小鼠采用脑立体定位注射技术在海马内注射腺相关空病毒载体和沉默PGC-1α病毒。术后的第一周每天观察小鼠的生命体征和恢复情况,每周同一时间对各组小鼠进行糖水偏好测试以评价小鼠的快感缺失水平。在注射后的第四周,各组小鼠的糖水偏好和强迫游泳出现显著性差异,给予AAV-GFP+RN组和AAV-PGC-1α+RN组小鼠为期四周的跑步锻炼,并于每周同一时间进行糖水偏好测试,干预结束后对各组小鼠进行旷场测试、悬尾测试以及强迫游泳测试。所有行为学检测结束后,按照上一部分的方法处理脑组织,并对海马各区各期的少突胶质细胞进行染色和计数。结果:(1)我们在荧光显微镜下观察小鼠脑组织冰冻切片,结果显示GFP仅在海马区域表达,提示病毒的定位注射部位正确。(2)病毒注射4周后进行行为学检测,发现与AAV-GFP组小鼠相比,AAV-PGC-1α组小鼠表现出糖水偏好水平显著下降、强迫游泳和悬尾试验的不动时间显著延长的抑郁样行为改变(p<0.05)。(3)四周的跑步锻炼干预后,AAV-PGC-1α组的糖水偏好百分比显著性低于AAV-GFP group组(p<0.05);AAV-GFP+RN组小鼠的糖水偏好百分比显著性高于AAV-PGC-1α+RN组(p<0.05),而AAV-PGC-1α+RN组小鼠的糖水偏好百分比与AAV-PGC-1α组相比无显著性差异(p(29)0.05)。(4)四周的跑步锻炼干预后,AAV-PGC-1α组小鼠的强迫游泳不动时间显著性长于AAV-GFP组小鼠(p<0.05);AAV-GFP+RN组小鼠的强迫游泳不动时间显著性短于AAV-PGC-1α+RN组小鼠(p<0.05),而AAV-PGC-1α+RN组小鼠的强迫游泳不动时间与AAV-PGC-1α组相比无显著性差异(p(29)0.05)。(5)四周的跑步锻炼干预后,AAV-PGC-1α组小鼠的悬尾测试不动时间与AAV-GFP group组相比无显著性差异(p>0.05);AAV-GFP+RN组小鼠悬尾测试不动时间显著性短于AAV-PGC-1α+RN组(p<0.05),而AAV-PGC-1α+RN组小鼠的悬尾测试不动时间与AAV-PGC-1α组相比无显著性差异(p(29)0.05)。(6)AAV-GFP组、AAV-GFP+RN组、AAV-PGC-1α组和AAV-PGC-1α+RN组四组小鼠的旷场试验总评分均无显著性差异(p(29)0.05)。(7)四组小鼠海马CA1内的CC1+成熟少突胶质细胞的体视学定量结果:AAV-PGC-1α组小鼠的海马CA1区内CC1+成熟少突胶质细胞数量显著性低于AAV-GFP组(p<0.05);AAV-GFP+RN组小鼠海马CA1区的CC1+成熟少突胶质细胞数量显著性高于AAV-PGC-1α+RN组(p<0.05),而AAV-PGC-1α+RN组小鼠的海马CA1区内CC1+成熟少突胶质细胞与AAV-PGC-1α组相比无显著性差异(p(29)0.05)。(8)AAV-GFP组、AAV-GFP+RN组、AAV-PGC-1α组和AAV-PGC-1α+RN组四组小鼠海马CA3区内CC1+成熟少突胶质细胞数量无显著性差异(p(29)0.05)。(9)四组小鼠海马DG内的CC1+成熟少突胶质细胞的体视学定量结果:AAV-PGC-1α组的海马DG区内CC1+成熟少突胶质细胞数量显著性低于AAV-GFP组(p<0.05);而AAV-GFP+RN组小鼠海马CA1区的CC1+成熟少突胶质细胞与AAV-PGC-1α+RN组小鼠相比无显著性差异(p>0.05)。(10)四组小鼠海马CA1区内Brd U+/Olig2+和CC1+/Brd U+/Olig2+免疫荧光阳性细胞的计数结果:AAV-PGC-1α组小鼠海马CA1区单位面积内的Brd U+/Olig2+和CC1+/Brd U+/Olig2+细胞数目显著性低于AAVGFP组小鼠(p<0.05,p<0.05);AAV-PGC-1α+RN组小鼠海马CA1区单位面积内的Brd U+/Olig2+和CC1+/Brd U+/Olig2+细胞数目显著性低于AAV-GFP+RN组(p<0.05,p<0.05),而AAV-PGC-1α+RN组小鼠海马CA1区单位面积内的Brd U+/Olig2+和CC1+/Brd U+/Olig2+细胞数目与AAV-PGC-1α组小鼠相比无显著性差异(p>0.05,p(29)0.05)。(11)四组小鼠海马CA3区内Brd U+/Olig2+和CC1+/Brd U+/Olig2+免疫荧光阳性细胞的计数结果:AAV-GFP组、AAV-GFP+RN组、AAVPGC-1α组和AAV-PGC-1α+RN组小鼠海马CA3区单位面积内Brd U+/Olig2+和CC1+/Brd U+/Olig2+细胞数目无显著性差异(p(29)0.05)。(12)四组小鼠海马DG区内Brd U+/Olig2+和CC1+/Brd U+/Olig2+免疫荧光阳性细胞的计数结果:AAV-GFP组、AAV-GFP+RN组、AAVPGC-1α组和AAV-PGC-1α+RN组小鼠海马DG区单位面积内Brd U+/Olig2+细胞数目无显著性差异(p(29)0.05)。AAV-PGC-1α组小鼠海马DG区单位面积内的CC1+/Brd U+/Olig2+细胞数目显著性低于AAVGFP组小鼠(p<0.05);AAV-PGC-1α+RN组小鼠海马DG区单位面积内的CC1+/Brd U+/Olig2+细胞数目显著性低于AAV-GFP+RN组(p<0.05),而AAV-PGC-1α+RN组小鼠海马DG区单位面积内的CC1+/Brd U+/Olig2+细胞数目与AAV-PGC-1α组小鼠相比无显著性差异(p(29)0.05)。结论:1、病毒注射4周后,海马内区域性沉默PGC-1α组小鼠表现出抑郁样行为。2、跑步锻炼并不能改善PGC-1α沉默组小鼠的抑郁样行为。3、跑步锻炼不能改善PGC-1α沉默组小鼠海马CA1区内OPC分化成熟的障碍。4、跑步锻炼可能通过PGC-1α通路促进海马内少突胶质细胞系的分化成熟从而改善小鼠的抑郁样症状。