本课题组已对PLLA/SF纤维支架的制备方法、生物相容性和理化性能进行了初步研究，并得出PLLA与SF以70:30、60:40和50:50的质量配比制得的复合纤维支架的生物相容性和理化性能较其他配比的支架和单纯PLLA支架、单纯SF支架优良。本实验率先通过体外和体内试验，研究将BMMSCs与PLLA/SF纤维支架复合，用于修复兔口腔粘膜创面，尝试构建理想的组织工程口腔粘膜，同时评估PLLA与SF以何种比例混合构建组织工程口腔粘膜支架最具潜力。本实验首先通过全身过敏反应试验、急性毒性试验、溶血试验、热原试验、BMMSCs在PLLA/SF纤维支架上的生长情况和细胞表型变化观察、BMMSCs与PLLA/SF纤维支架复合物的结构观察、支架皮下移植试验和支架口腔粘膜移植试验对PLLA/SF纤维支架的生物相容性进行评估，探讨PLLA/SF纤维支架作为口腔粘膜组织工程支架的可行性，为将BMMSCs与PLLA/SF纤维支架复合提供实验依据。随后通过BMMSCs与PLLA/SF纤维支架复合物的口腔粘膜移植试验、比较细胞与支架复合物组、单纯支架组、创面自然修复组的创面愈合率，评估BMMSCs与PLLA/SF纤维支架复合物的生物相容性，以及BMMSCs与PLLA/SF纤维支架复合物修复兔口腔粘膜创面的效果，为BMMSCs与PLLA/SF纤维支架复合物修复口腔粘膜的可行性提供实验依据，同时评估PLLA与SF以何种比例混合构建组织工程口腔粘膜支架最理想。材料与方法1.通过体外和体内试验对PLLA/SF纤维支架的生物相容性进行评估。1.1通过全身过敏反应试验（以敏感的豚鼠为试验对象）、急性毒性试验（以敏感的昆明小白鼠为试验对象）、溶血试验（采用新西兰白兔血）和热原试验（以新西兰白兔为试验对象）对质量配比分别为70:30（P70S30）、60:40（P60S40）和50:50（P50S50）的PLLA/SF纤维支架材料的生物相容性进行了评估。1.2BMMSCs在PLLA/SF纤维支架上复合培养：分离、培养及鉴定兔BMMSCs。将BMMSCs置于PLLA/SF纤维支架上复合培养，应用倒置显微镜观察BMMSCs在PLLA/SF纤维支架上的生长情况；采用CCK-8（Cell counting kit-8）试剂盒检测细胞增殖活性，以无支架的细胞培养组为对照组；采用免疫荧光染色鉴定BMMSCs细胞表型变化。应用激光共聚焦扫描显微镜和扫描电镜观察复合物结构。2.通过体内植入试验对PLLA/SF纤维支架、BMMSCs与PLLA/SF纤维支架复合物的生物相容性及修复兔口腔粘膜创面的效果进行评估。2.1将已经过灭菌处理的PLLA/SF纤维支架植入豚鼠背部皮下及新西兰白兔口腔粘膜创面处，一周后取包裹了移植物的组织，行组织固定、包埋、切片及HE染色，观察支架的生物相容性。以单纯创面组为空白对照组。2.2将BMMSCs与PLLA/SF纤维支架组成的复合物缝合于新西兰白兔口腔粘膜创面处，一周后取包裹了移植物的组织，行组织固定、包埋、切片及HE染色，观察复合物的生物相容性。取单纯支架修复创面组作为实验的对照组。2.3将经Dil染色的BMMSCs与PLLA/SF纤维支架的复合物缝合于新西兰白兔口腔粘膜创面处，一周后将新西兰白兔处死，将复合物与其周围口腔粘膜组织一同取下，固定，脱水，石蜡包埋，切片，烤片，用Actin-Tracker Green染色，激光共聚焦扫描显微镜下观察BMMSCs与周围组织融合情况。2.4创面愈合率统计：共设计七组参与创面愈合率的比较，分别是自然修复组，单纯P70S30支架组，单纯P60S40支架组，单纯P50S50支架组，P70S30的PLLA/SF与BMMSCs复合物组，P60S40的PLLA/SF支架与BMMSCs复合物组，P50S50的PLLA/SF支架与BMMSCs复合物组。将创面照片输入计算机，应用DP2-BSW显微图像控制及分析软件进行分析，计算创面愈合率。采用SPSS21.0统计软件进行数据分析。数据组间比较采用SNK-q检验，P<0.05为有统计学意义。创面愈合率的计算公式如下。创面愈合率=（原始创面面积-未愈合创面面积）÷原始创面面积×100%结果1.全身过敏反应试验结果：三种质量配比的PLLA/SF纤维支架的浸提液均没有导致豚鼠出现竖毛、抓鼻、颤抖、抽搐、呼吸困难、大小便失禁、休克甚至死亡等过敏症状。其过敏反应程度分级为0级。2.急性毒性试验结果：所有昆明小白鼠在72小时的观察期内，一般状态良好，活动正常，进食水正常，睡眠正常，无抽搐、呼吸困难和死亡等毒性反应。实验前后昆明小白鼠的体重无明显变化，与对照组比较无明显差别，各组昆明小白鼠每日体重平均增加量差别无统计学意义（P>0.05）。3.溶血试验结果：实验组和阴性对照组中的各离心管离心后，上层均为无色液体；阳性对照组中的各离心管离心后，上层为红色液体。测得吸光度值，按照溶血率计算公式计算溶血率，结果是三种质量配比的PLLA/SF复合纤维支架的溶血率均小于5%。按照国际标准化组织（International organization for standardization，ISO）标准，认为本实验受试材料符合溶血试验的要求。4.热原试验结果：每只新西兰白兔的体温升高均不超过0.6℃，每组新西兰白兔的体温升高总和也均低于1.4℃，按照药典热原试验的检测规定，认为本实验受试材料符合热原试验的要求。5.兔BMMSCs的分离、培养及鉴定结果：成功分离并培养兔BMMSCs，细胞生长及增殖情况良好；通过免疫荧光染色，应用抗体CD105和抗体CD44鉴定出所分离培养的细胞表面CD105和CD44表达阳性，证实所分离培养的细胞为BMMSCs。6. BMMSCs在PLLA/SF纤维支架材料上的生长及细胞表型变化情况：BMMSCs在PLLA与SF的质量配比为70：30的复合纤维支架材料上的细胞增殖速率明显快于PLLA与SF的质量配比为60：40组和50:50组，在第5天和6天时间点差别有统计学意义（p<0.01）。在支架上生长的细胞CD105和CD44表达阳性，证实PLLA/SF纤维支架材料对BMMSCs的细胞表型无明显影响。7. BMMSCs与PLLA/SF纤维支架共培养复合物结构观察结果：激光共聚焦扫描显微镜和扫描电镜下看到BMMSCs均能粘附在三种质量配比的PLLA/SF纤维支架上，细胞生长状态均良好。8. PLLA/SF纤维支架的皮下移植试验结果：PLLA/SF纤维支架于豚鼠背部皮下植入一周后，取材行HE染色观察移植材料的组织相容性。结果显示，三种质量配比的支架材料炎性细胞浸润程度均较轻，其中以PLLA与SF的质量比为70：30的纤维支架炎性反应最轻。材料植入体内一周时间内所有动物一般状态良好，日常活动、进食水及睡眠无异常，实验动物无明显的免疫排斥反应，无全身及局部并发症。9. PLLA/SF纤维支架的口腔粘膜移植试验结果：PLLA/SF纤维支架体内植入后，可以分别看到P70S30、P60S40、P50S50三种质量配比的PLLA/SF纤维支架与创面的融合均较好，一周后可以看到PLLA/SF纤维支架有所降解，口腔创面大部分愈合；各组较之对照组无明显炎性反应加重，支架周围及支架降解部分有纤维结缔组织生长（见图4.2-图4.5）。材料植入体内一周时间内所有动物一般状态良好，日常活动、进食水及睡眠无异常，试验动物无明显的免疫排斥反应，无全身及局部并发症。10. BMMSCs与PLLA/SF纤维支架组成的复合物的口腔粘膜移植试验结果：BMMSCs与PLLA/SF纤维支架组成的复合物体内移植后，可以分别看到P70S30、P60S40、P50S50三种质量配比的PLLA/SF纤维支架材料与创面的融合均较好，一周后看到PLLA/SF纤维支架材料有所降解，口腔创面有所愈合；各组无明显炎性反应加重，支架周围及支架降解部分有纤维结缔组织生长。与PLLA/SF纤维支架材料组相比较，BMMSCs与PLLA/SF纤维支架材料组成的复合物组引发机体的炎性反应轻。材料植入体内一周的时间内所有动物一般状态良好，日常活动、进食水及睡眠无异常，实验动物无明显的免疫排斥反应，无全身及局部并发症。通过Actin-Tracker Green染色在激光共聚焦扫描显微镜下可以看到，与创面自然愈合的对照组相比，三种质量配比的BMMSCs与PLLA/SF纤维支架组成的复合物组中的BMMSCs与周围正常组织均有不同程度融合，以PLLA与SF的质量配比为70:30的复合物组中的BMMSCs与周围组织融合程度最深。11.愈合率统计结果：BMMSCs与PLLA/SF纤维支架材料组成的复合物组愈合率高，其中以PLLA与SF的质量配比为70：30的复合物组愈合率最高，平均愈合率为94.8%，PLLA与SF的质量配比为60：40的复合物组平均愈合率为90.7%，PLLA与SF的质量配比为50：50的复合物组平均愈合率为89.5%，PLLA与SF的质量配比分别为70:30、60:40和50:50的单纯支架组对应的平均愈合率分别为87.8%、85.4%和83.6%，创面自然愈合组平均愈合率为82.4%，PLLA与SF的质量配比为70：30的复合物组愈合率较创面自然修复组及单纯支架组差别有统计学意义（P<0.01）。结论1. PLLA/SF纤维支架材料具有良好的生物相容性，具有作为组织工程口腔粘膜支架的潜力。2. BMMSCs与PLLA/SF纤维支架材料组成的复合物较单纯PLLA/SF支架具有更好的生物相容性，较单纯PLLA/SF支架及机体自行修复能力具有更强的口腔粘膜修复能力，率先证实BMMSCs与PLLA/SF纤维支架材料组成的复合物具有构建理想的组织工程口腔粘膜的潜力。3. PLLA与SF的质量配比为70:30时的BMMSCs与PLLA/SF纤维支架材料组成的复合物最利于BMMSCs生长、与周围组织融合及口腔粘膜创面愈合，构建理想的组织工程口腔粘膜的潜力最大。