手足口病(hand-foot-and-mouth disease, HFMD)是一种全球性的疾病,自上个世纪九十年代以来,在中国大陆、台湾、新加坡和亚洲其它地区一直保持高发态势,其易感人群主要是5岁以下婴幼儿,该疾病易致罹患者并发神经系统相关重症,甚至可能引发死亡,已经成为严重危害儿童健康和公共卫生安全的重要传染性疾病。研究表明,HFMD的致病原主要是小核糖核酸病毒科的肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus A 16, CA16)。近年来对于HFMD的研究大多数集中于EV71的感染,而对CA16的感染缺乏足够的重视。临床上,EV71感染易引发重症病例及死亡病例,而CA16感染所致的症状普遍较轻,但CA16感染所致HFMD患者一旦发展到重症阶段,其基本情况和临床症状特征基本与EV71感染病例一致。另外,CA16病毒在人群中的重复感染的流行病学现象也越来越引起人们的广泛关注。尽管EV71灭活疫苗已经上市,但EV71与CA16感染导致的临床症状的差异,以及两者的感染机制与免疫机理仍不十分清楚,这些问题依然需要更深入的研究。基于本实验室在前期研究中建立的CA16婴猴感染模型,本论文的第一部分首先对CA16重复感染恒河猴婴猴的全基因组表达谱进行了分析,结果显示,与恒河猴婴猴感染CA16前相比,恒河猴婴猴感染CA16后各个时间共出现了948个共同差异基因；将这些差异基因进行基因本体论(Gene Ontology, GO)分析后发现：这些差异基因主要集中在5个生物学过程,包括：细胞通讯、细胞周期、免疫系统过程、转录调节、代谢过程,说明在恒河猴婴猴感染CA16的不同阶段中,这5个生物学过程参与了其引发疾病的进程；随后,我们对各类基因中上调和下调最显著的10个基因进行了共表达网络分析,发现IL-6、IL-8、IL-18等作为了关键调控基因,它们是参与炎症反应及免疫反应的重要相关基因；紧接着我们对免疫相关的基因进行了通路分析,发现其主要分布在趋化因子和细胞因子介导的炎症通路以及白介素信号通路,进一步说明在恒河猴婴猴感染CA16的不同阶段中,炎症反应与免疫反应发挥着主要作用。围绕着机体抗病毒的固有免疫反应Ⅰ型干扰素(Type Ⅰ Interferon, IFN-I)动员的特征,最后我们还对芯片中与IFN-I产生相关的基因及与细胞自噬相关的基因进行了分析,结果发现与IFN-I产生相关的基因和自噬相关的基因大多发生了下调表达,这为后续的研究提供了线索和依据。本论文的第二部分根据第一部分提供的线索,将EV71与CA16直接感染人正常呼吸道上皮细胞16HBE,并检测两者感染后IFN-I产生相关基因的改变,结果发现,与对照组相比,EV71感染组中TLR3、MAVS、MDA5、MyD88、IRF7、 IFNα和IFNβ的基因表达量均发生了显著性地上调,而在CA16感染组中TLR3和IRF3的基因表达水平显著性地下降,TLR7、MAVS、RIG-I、MyD88、IRF7、 IFNα和IFNβ的基因表达水平均无显著性地变化。此外,病毒滴度和病毒载量的检测结果显示,相比于EV71感染组,CA16感染组在16HBE上的复制效率更高。上述结果提示：尽管EV71感染16HBE后可能会显著性地诱发IFN-I产生相关通路的激活,但产生的IFN-I尚不足以抵抗EV71的入侵,故EV71感染16HBE后仍可实现增殖,而CA16感染16HBE后并不能触发IFN-I的产生,因此,推测CA16感染16HBE后可能诱发了某种机制使其逃避了其在16HBE上的天然免疫反应,并使其更容易在16HBE上实现快速地增殖,这揭示了EV71与CA16可能通过不同的途径增强其自身的感染能力。本论文的第三部分在第二部分的基础上,进一步探究引发EV71和CA16感染所致IFN-I产生差异性的原因,故我们锁定在EV71和CA16感染16HBE后诱发的细胞自噬现象对IFN-I产生及病毒受体表达的影响。结果显示,无论是16HBE中的内源性LC3染色还是将外源性转荧光标记的LC3质粒导入16HBE,我们均发现在EV71感染后可诱导16HBE细胞发生完全自噬,而CA16感染则诱导16HBE细胞发生非完全自噬；在给予自噬抑制剂3MA后,EV71与CA16感染的16HBE的细胞活性显著性地下降,病毒空斑形成单位(plaque forming units, PFUs)显著性地下降,且在自噬现象被抑制后,在基因水平上,TLR7、MyD88、 IRF7介导的IFN-I的产生在EV71与CA16感染的16HBE中显著性地上升,而在蛋白水平上,TLR7、MyD88、IRF7也在EV71与CA16感染的16HBE中显著性地上升,另外,免疫荧光的结果也显示TLR7与内体标志物M6PR不仅存在共定位现象,而且在抑制EV71与CA16诱导的自噬后TLR7的表达强度显著性增加,这些结果说明EV71与CA16感染均可以通过诱导细胞自噬而抑制TLR7、 MyD88、IRF7介导的IFN-I的产生,进而促进病毒自身的包装成熟。此外,我们还发现,在抑制EV71与CA16诱导的自噬后,EV71与CA16在16HBE上的病毒入侵受体SCARB2和CD162的阳性细胞比例也会显著性地下降,说明EV71与CA16可能通过诱发自噬的发生而促进其感染细胞受体的表达,进而增强其自身的入侵。上述结果提示EV71与CA16感染可能通过抑制IFN-I和促进病毒受体的表达来协作病毒参与免疫逃逸。综上所述,本研究首先通过对CA16感染恒河猴的全基因组表达谱的分析,首次揭示了CA16感染引起的差异基因表达谱；随后通过比较EV71与CA16感染16HBE后IFN-I产生相关基因的变化,发现EV71和CA16可以通过不同的模式识别受体及下游信号分子而诱发差异性的IFN-I产生,且IFN-I的产生可能会直接影响两者在16HBE上的感染和增殖能力；最后还探讨了EV71和CA16诱导的自噬对WN-I产生和病毒受体表达的影响,发现EV71和CA16感染可分别引发完全自噬与非完全自噬现象,且两者均可以通过诱发自噬而抑制TLR7、 MyD88、IRF7的表达,从而来抑制IFN-I的产生水平,另外,EV71和CA16也均可以通过诱发的自噬来促进病毒受体的表达。本论文的研究结果为CA16感染和免疫机理研究提供了线索,初步解释了CA16重复感染的机理,并部分了揭示了EV71和CA16参与免疫逃逸的机理,为EV71和CA16引起的HFMD的治疗提供了新的靶点。