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研究背景:败血症心肌病(SIC)严重影响败血症预后。目前对SIC缺乏有效的治疗手段,寻找SIC的防治方法至关重要。研究证实,心肌肌浆网钙三磷酸腺苷酶(SERCA2a)功能下调是SIC发生的重要原因,但其下调的机制没有阐明。受磷蛋白(PLB)是调控SERCA2a功能的重要蛋白,在机体内有两种存在形式,单聚体monomer和五聚体pentamer。单聚体能直接与SERCA2a结合,抑制SERCA2a的Ca2+摄取功能,而五聚体被认为是PLB在体内的储存形式,不具有生物功能和活性[6]。上述两种PLB存在形式在体内保持动态平衡。然而,目前还没有研究指出败血症是否能影响心肌PLB的存在形式进而下调SERCA2a功能。白藜芦醇(RSV)对多种心血管疾病中有治疗作用。我们的预实验发现RSV能预防SIC的发生。在这基础上,我们拟研究RSV是否对SIC有治疗作用,并探讨其机制是否与纠正SERCA2a-PLB异常有关。研究目的:1.RSV是否能治疗SIC。2.RSV治疗SIC的机制是否与纠正SERCA2a-PLB有关。3.RSV调控SERCA2a-PLB的机制。研究方法:采用腹腔注射(i.p.)大肠杆菌脂多糖(LPS,sigma corporation,055:B5 serotype,6 mg/kg)的方法建立小鼠SIC模型。雄性C57BL/6J小鼠(8周龄)分为4组,依次是对照组,RSV组,LPS组和LPS+RSV组。建模成功后,用动物心脏超声机测量小鼠心功能指标如:左室射血分数(EF%)、短轴缩短率(FS%)和左室舒张末期内径(LVEDD)等。并分离心肌细胞,测量不同条件下心肌细胞收缩力、钙瞬变曲线和活性氧水平。应用H-E染色观察心肌组织结构是否改变,使用免疫组织化学法检测心肌切片CD45+炎症细胞浸润数量。应用酶-抗体夹心法(ELISA)测量血浆Tn I和TNF-α、心肌ATP、MDA含量和心肌细胞/组织SERCA2a ATP酶活性。应用Western blot和或Real time PC R法检测心肌4-HNE、SERCA2a、NCX、Ry R2、IP3R、TNF-α、PLB、cleaved Caspase-3、Pgc-1α、Nrf-2及下游蛋白(CAT和NQO-1)表达情况。研究结果:1.LPS使EF%、FS%下降50%以上,伴有LVEDD显著增大,而在LPS注射后2小时用RSV治疗能显著纠正上述异常。离体细胞实验,LPS使细胞收缩幅度和钙瞬变峰值显著下降,收缩后恢复时间和钙瞬变衰减时间显著延长,而RSV能明显纠正心肌细胞机械功能和钙释放异常。2.血浆Tn I和心肌cleaved Caspase 3表达在LPS处理的小鼠中没有升高。血浆TNF-α在LPS处理的小鼠中显著升高,伴有心肌组织CD45+炎性细胞浸润明显增加,而心肌组织TNF-α表达水平在各组小鼠之间没有显著差异。RSV不降低血浆TNF-α水平,不减少心肌组织CD45+炎性细胞数量,心肌NCX、Ry R2和IP3R表达水平在各组之间无差异。心肌SERCA2a在LPS处理的小鼠中表达下降,活性降低,而RSV治疗可以上调SERCA2a表达,改善活性。3.LPS使心肌monomer-PLB增多,pentamer-PLB减少,这与LPS引起的氧化还原紊乱有关。LPS上调心肌4-HNE和MDA的含量,下调Nrf-2及下游蛋白(CAT和NQO-1)的表达,RSV治疗能明显减轻上述异常。离体细胞实验进一步发现:RSV能起到和一种ROS清除剂,N-乙酰半胱氨酸相似的作用,减少心肌细胞ROS水平,恢复受到抑制的SERCA2a功能,促进PLB从monomer转变为pentamer。结论:1.RSV能治疗SIC。2.RSV治疗SIC的机制与促进PLB从单聚体向五聚体转变,进而上调心肌SERCA2a功能有关。3.RSV调控PLB构象改变的机制与激活Nrf-2,调控细胞氧化还原有关。创新点:1.RSV通过激活Nrf-2,促进PLB从单聚体向五聚体转变,恢复受抑制的SERC A2a功能,对SIC起到治疗作用。2.本研究有望为白藜芦醇(或Nrf-2的直接激动剂)应用于临床防治SIC提供理论依据。综上所述,本研究首次阐明了RSV治疗SIC的一种新的机制:RSV通过激活Nrf-2及下游基因,调节细胞内氧化还原状态,促进心肌PLB从monomer向pentamer转变,恢复受抑制的SERCA2a功能。