论文部分内容阅读
E-cadherin介导的细胞粘附在大部分上皮细胞癌中缺失,进而诱导恶性细胞的侵袭和转移。p120作为E-cadherin粘附复合体的重要调节子,负责维持E-cadherin的稳定性和平衡周转。p120的缺失能够促使E-cadherin细胞内吞而降解,从而导致细胞粘附的降低及肿瘤恶性度的增加。因此,研究p120与E-cadherin相互作用的调节机制具有重要意义。研究发现,p120蛋白的翻译后修饰参与了E-cadherin粘附复合体功能的调节。如p120的磷酸化修饰参与调控E-cadherin介导的细胞与细胞粘附。O-GlcNAc是一种发生在蛋白质丝氨酸和苏氨酸残基上的O连接的N-乙酰葡萄糖胺(O-linked β-N-acetylglucosamine)单糖修饰,O-GlcNAc修饰基团添加和移除分别由糖基转移酶(O-GlcNAc transferase, OGT)和糖苷酶(O-GlcNAcase, OGA)完成。O-GlcNAc修饰参与调节细胞粘附、信号转导、基因转录等生命活动,影响相关蛋白的定位、蛋白质间相互作用、蛋白降解等。O-GlcNAc修饰的异常与糖尿病、神经退行性疾病和心血管疾病等多种人类疾病相关。本实验室前期证明,O-GlcNAc修饰在多种肿瘤中发挥重要调节作用,增加细胞O-GlcNAc修饰水平可抑制小鼠乳腺癌4T1细胞中E-cadherin的膜分布,影响细胞粘附能力,并发现4T1细胞中p120蛋白被O-GlcNAc修饰。基于以上结果,我们推测p120的O-GlcNAc修饰可能参与了O-GlcNAc调节E-cadherin介导的细胞间粘附这一过程。因此,本论文对p120的O-GlcNAc修饰及OGT蛋白在p120与E-cadherin相互作用过程中的调节作用及其分子机制进行深入研究。为了研究O-GlcNAc修饰对E-cadherin介导的细胞粘附的调控是否具有普遍性,本论文利用免疫荧光、免疫共沉淀和免疫印迹等技术在其它几种细胞中检测了O-GlcNAc修饰对p120/E-cadherin复合体的调节作用。结果表明,O-GlcNAc修饰降低人胚肾细胞HEK293、肺癌细胞A549、前列腺癌细胞BPH-1中p120和E-cadherin在粘附复合体中的分布,抑制p120和E-cadherin的结合。前期实验发现小鼠乳腺癌4T1细胞中的p120存在O-GlcNAc修饰,本研究采用多种O-GlcNAc修饰检测技术,检测了不同细胞中(人胚肾细胞HEK293T、人非小细胞肺癌细胞H1299和人腺癌肺泡基底上皮细胞A549)p120的O-GlcNAc修饰。结果表明,以上三种细胞中,p120均存在O-GlcNAc修饰；并且,通过OGT沉默或过表达OGT改变细胞总糖链,p120的O-GlcNAc修饰水平也随之发生变化。上述实验证明O-GlcNAc对p120/E-cadherin复合体形成的调节作用以及p120的O-GlcNAc修饰在多种细胞中普遍存在,我们进而研究了p120的O-GlcNAc修饰是否在其与E-cadherin结合过程中发挥调节作用。我们发现在HEK293T细胞中,与E-cadherin粘附复合体结合的p120的O-GlcNAc修饰水平明显低于非结合的p120。另外,Flag-Pulldown结果显示,具有高水平O-GlcNAc修饰的p120与E-cadherin的结合能力低于具有低修饰水平的p120。这些结果说明p120的O-GlcNAc修饰对p120与E-cadherin的结合起负调节作用。为研究p120的O-GlcNAc修饰抑制其与E-cadherin结合的机制,p120被分割成四个截短突变体(N端区、磷酸化调节区、Armadillo结构域和C端区),并检测各突变体的O-GlcNAc修饰水平,确定O-GlcNAc修饰的主要区域为Armadillo结构域。利用上述相同方法证明Armadillo结构域上的O-GlcNAc修饰抑制其与E-cadherin的结合。这些结果表明,O-GlcNAc可能通过对p120 Armadillo区的修饰,抑制p120与E-cadherin的相互作用。由于p120具有O-GlcNAc修饰,因此我们进一步检测了OGT与p120的相互作用。免疫共沉淀和Pulldown实验表明,OGT蛋白可与p120蛋白通过磷酸化调节区或Armadillo结构域直接结合；但OGT不能与E-cadherin结合,并且OGT不能结合到p120/E-cadherin复合体上。由于Armadillo结构域也是E-cadherin结合区,因此我们推测是否OGT与p120的结合可抑制p120与E-cadherin的结合。体外蛋白结合实验证明,OGT浓度依赖性地抑制p120与E-cadherin的相互作用；体内实验证明OGT不依赖其催化活性也可抑制E-cadherin粘附复合体的形成,该作用可能通过其与p120的结合实现。这些发现为p120与E-cadherin的相互作用以及E-cadherin介导的细胞粘附提供了新的调节机制。综上所述,本文首次证明在不同细胞系中p120的O-GlcNAc修饰具有普遍性,并且p120的O-GlcNAc修饰抑制其与E-cadherin的结合；通过体内体外实验首次证明OGT不依赖其催化活性也可抑制E-cadherin粘附复合体的形成。本研究不仅为p120/E-cadherin粘附复合体的形成以及O-GlcNAc降低细胞粘附、促进肿瘤发生发展提供新的调节机制,而且为癌症的靶向治疗提供重要启示和理论依据。