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研究背景癫痫(epilepsy)是神经系统一种慢性疾病,其特点是大脑神经元反复发作性异常放电引起相应的突发性和一过性脑功能障碍。癫痫反复发作及癫痫持续状态,会对脑组织造成损伤,严重时常遗留一定的认知及运动功能障碍,影响患儿的身心健康。研究发现,癫痫发病可能与“神经-免疫-内分泌”网络失衡有关。近几年炎性小体成为中枢神经系统疾病的研究热点。炎性小体有NLRPl-NLRPl4共14个亚家族组成,其中NLRPl、NLRP3、NLRC4、AIM2等是主要的炎性小体。目前,在中枢神经系统中,NLRP3炎性小体是研究最为深入的炎性小体之一,其有NOD样受体、接头蛋白ASC和效应蛋白caspase-l组成。当细胞受到外界信号刺激后,NLRP3炎性小体被激活,激活的NLRP3炎性小体进一步激活caspase-1,激活的caspase-1将pro-IL-1β切割为IL-1β,IL-1β是一个重要的促炎症因子,对细胞活化和细胞因子的产生有重要的诱导作用,IL-1β可产生一系列的级联放大作用,促进炎症反应,对脑组织造成损伤。国内外研究发现,NLRP3炎性小体参与了多种神经系统疾病的发病过程,如:癫痫、脑卒中、多发性硬化、帕金森病、阿尔茨海默病、颅内感染等。研究发现。在癫痫模型中,敲除NLRP3或caspase-1基因后,IL-1β表达减少,并延缓癫痫发作和减弱癫痫反复发作的严重程度,减少海马区神经元的死亡,进而减轻癫痫脑损伤。褪黑素作为松果体分泌的一种吲哚类激素,具有随光周期昼夜节律性分泌的特点,具有清除自由基、抗氧化、抗炎和免疫调节作用。褪黑素作为睡眠调节药物,在国外已应用于临床。近几年发现褪黑素在多种疾病造成的脑损伤中具有脑保护作用,如:缺氧缺血性脑病、癫痫、颅内感染、脑卒中、胆红素脑病。研究发现,在癫痫模型中,褪黑素可以通过影响神经递质的释放及其受体的表达、凋亡因子的表达等发挥脑保护作用。褪黑素作为一种脑保护药物,在癫痫中是否可以通过对炎性小体的影响发挥脑保护作用,目前国内外尚未见报道。研究目的本研究通过建立氯化锂-匹罗卡品癫痫模型,采用褪黑素进行干预治疗,通过比较各组大鼠海马组织中NLRP3、caspase-1、IL-1β的表达,旨在探讨NLRP3炎性小体在癫痫大鼠海马组织中的表达及褪黑素脑保护作用的可能机制,为癫痫患儿提供一种可能的脑保护药物。研究方法1实验动物分组健康清洁级21-30天(相当于人类幼儿期)SD大鼠144只,雌雄不限,体重在50-100g,实验分为对照组,癫痫组,褪黑素组,每组大鼠48只,每组大鼠按照癫痫发作后24h、48h、72h、7d时间点再分为4个亚组,每亚组12只大鼠。2模型建立及药物干预模型建立参考文献并加以改进,褪黑素组于癫痫发作30min后给予单次腹腔注射褪黑素(25mg/kg),对照组腹腔注射相同剂量的生理盐水,观察各组大鼠癫痫发作情况,痫性发作达到IV级或其以上且持续30min以上被认为造模成功,未达到IV级或其以上的每间隔30min注射一次匹罗卡品(50mg/kg),直到发作达IV级或其以上,但匹罗卡品总计量不超过450mg/kg。大鼠癫痫发作症状评估采用Racine分级标准。3脑组织标本采集各组大鼠分别在24h、48h、72h、7d时间点应用100g/L水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉,完全麻醉后,将大鼠取仰卧位,四肢用医用胶带固定,局部消毒后打开胸腔,暴露心脏,输液针从左心室心尖处刺入并固定,剪开右心耳,用生理盐水心脏灌注,开颅取脑组织,并立即在冰块上分离海马,将海马组织迅速放入液氮速冻,并移至-80℃低温冰箱内保存备用,用于行荧光定量PCR检测。剩余各组大鼠行生理盐水心脏灌注,40g/L多聚甲醛固定,开颅取脑,并修剪脑组织,放入40g/L多聚甲醛中固定48h,然后脱水包埋,采用连续冠状位切片,行免疫组织化学染色。4免疫组化石蜡切片进行常规脱蜡水化,修复抗原,滴加过氧化氢去离子水抑制内源性过氧化物酶,正常山羊血清工作液封片,依次滴加一抗、二抗及辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液,二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木精复染,脱水封片。细胞质内呈棕黄色或棕褐色为阳性细胞。5荧光定量PCR用Trizol试剂提取大鼠海马组织中总RNA,测RNA纯度和浓度,将RNA反转录为cDNA,以cDNA为模板行PCR扩增,荧光定量PCR样品反应体系应用SYBR Green I,其最终的反应体系20微升。反应条件为:95℃30s预变性,95℃5s变性,55℃10s退火,72℃30s延伸,共40个循环。6统计学处理应用统计学SPSS 21.0软件进行分析。计量资料用均数±标准差(±s)表示;多组间数据比较用单因素方差分析;多组间两两比较用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1免疫组化结果癫痫组与褪黑素组海马区NLRP3、caspase-1、IL-1β阳性细胞数在同一时间点均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),癫痫组NLRP3、caspase-1、IL-1β阳性细胞数在72h达到高峰,同一时间点褪黑素组NLRP33、caspase-1、IL-1β阳性细胞数低于癫痫组,差异均有统计学意义(P<0.05)。2荧光定量PCR在同一时间点,癫痫组和褪黑素组海马区NLRP3、caspase-1、IL-1β的RNA相对表达量均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),癫痫组NLRP3、caspase-1、IL-1β的RNA相对表达量在72h达到高峰;在同一时间点褪黑素组海马区NLRP3、caspase-1、IL-1β的RNA相对表达量较癫痫组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论NLRP3炎性小体在癫痫发作后被激活,其可能参与了癫痫的发病过程;褪黑素可以通过抑制NLRP3炎性小体的表达发挥脑保护作用。