精子发生是个复杂、多步骤的过程,可分为三个过程:精原细胞的增殖更新、精母细胞的成熟分裂和精子细胞变态为精子三个阶段。目前发现在曲细精管中uPAR主要表达在精子细胞,可能与精子的排放有关。Tong Zhang等应用原位杂交技术检测发现猕猴睾丸支持细胞在精子发生的特定阶段(VII～VIII期)表达uPA mRNA;uPAR mRNA由睾丸生精细胞产生,但是不同发育阶段及不同生殖细胞表达的差异表明uPA/uPAR系统可能在精子发生过程中的特定阶段起作用。Vassalli认为支持细胞这种时期特异性表达的uPA与生殖细胞uPAR结合后可能是通过激活uPAR介导的信号传导通路作为生长因子而起作用。但是uPAR是通过激活何种信号传导通路来调节精子的发生过程目前尚不清楚。uPAR是否还通过信号传导来刺激生精细胞的发生及分化功能呢?因此,uPAR在精子发生中的作用机制尚待进一步研究。然而由于睾丸组织结构和功能的复杂性,一般情况下很难在整体情况下对生殖细胞的生理生化功能和与其他细胞的相互作用进行深入研究。生精细胞培养技术的建立为深入地了解生精细胞发育过程,研究生精细胞自身及与其它生精细胞的关系,提供了一种新的、强有力的工具。RNA干扰(RNAi)是一种由双链小干扰RNA(siRNA)引发的转录后基因沉默(PTGS)新型机制,可导致靶基因mRNA的降解及特异性基因沉默信号的扩增。目前siRNA已经成为选择性沉默体外培养的哺乳细胞基因表达的一个有力工具。本实验首先应用实时RT-PCR和Western Blot检测出生后不同发育阶段大鼠睾丸中uPAR基因及蛋白表达的变化,然后建立的生精细胞体外培养体系,最后应用siRNA沉默技术阻断体外培养生精细胞uPAR的基因表达,为研究uPAR在精子发生中作用机制及信号传导通路的研究提供新的重要研究手段和技术平台。一、uPAR在大鼠睾丸第一精子发生波中的表达变化目的:为探讨uPAR在大鼠精子发生中的作用,研究在第一个精子发生波中大鼠睾丸组织uPAR的mRNA表达及蛋白表达变化。方法:将SD大鼠按生后年龄分组,以出生当天为d0,取出生后d0、d5、d10、d15、d21、d28、d35、d42、d49、d56大鼠睾丸组织,用实时荧光定量分析方法检测各年龄组大鼠uPAR mRNA表达,并用Western印迹法检测各年龄组大鼠uPAR蛋白表达。结果:大鼠睾丸组织uPAR mRNA表达与蛋白表达表现出相似的趋势:刚出生时表达水平较高,后逐渐下降,约在d15天达最低,到d28时开始增加,到d35时到达高峰,随后d42下降,后保持一定的水平。双变量回归相关分析显示uPAR mRNA表达与蛋白表达为中度正相关。结论:大鼠睾丸uPAR表达在第一精子发生波中出现两个高峰,第一高峰在刚出生时,这个时期生殖母细胞向基底部迁移的时期,这在精子以后的发生中起着至关重要的作用,说明uPAR与精子发生的启动有着密切联系。第二高峰是在第5周升高明显,第5周为精子变形并开始向管腔排放的时期,这说明uPAR可能参与精子排放过程中的组织重塑及精子变态过程。二、大鼠睾丸生殖细胞培养体系的建立大鼠睾丸生殖细胞培养体系的建立是体外研究睾丸精子发生过程中各种调控因素的的重要工具。本实验通过建立支持细胞及生精细胞两种培养体系,为进一步研究uPAR在精子发生中的作用奠定基础。(一)大鼠睾丸支持细胞的分离纯化和鉴定目的培养高纯度的大鼠睾丸支持细胞,并应用检测ABP mRNA原位杂交方法鉴定分离培养的支持细胞。方法选用18～22天龄SD雄性大鼠睾丸,采用0.25%胰蛋白酶、0.1%透明质酸酶、0.1%胶原酶三酶依次消化法分离支持细胞,放于32℃5%CO2的培养箱培养,48小时后用20mmol Tris—HCl低渗处理培养细胞。培养一周后应用伊红染色、吖啶橙荧光染色、Feulgen染色对所培养支持细胞进行鉴定,同时应用原位杂交检测ABP mRNA方法鉴定分离培养的支持细胞。结果培养一周后所获培养的支持细胞纯度达95%以上。分离培养的支持细胞ABP mRNA表达阳性,其形态结构特征与用其它方法鉴定为支持细胞的形态结构特征一致。结论采用三酶连续消化及低渗处理法分离培养的支持细胞纯度高,而且应用原位杂交方法检测ABP mRNA是一种新的、特异、有效的鉴定支持细胞及其功能的方法。(二)大鼠睾丸支持细胞/生精细胞共培养系统的建立目的建立生精细胞体外分化培养体系,为uPAR在精子发生中作用的体外研究提供一个很好的研究模型。方法取20～22天龄SD雄性大鼠睾丸,去被膜及血管,放在预冷的Hank’s液中洗两次,然后用加1 mg/ml胶原酶的F12/DMEM液32℃消化15～20min。用眼科剪将睾丸剪碎成非常小的片断,再重复用1 mg/ml胶原酶消化5～10min。细胞用内含10%胎牛血清及各种营养因子的HamF12/ DMEM培养液悬浮,约按1*106CELL/cm2的密度接种于双室培养槽或放有盖玻片的六孔板中,在32℃、5%CO2条件下培养。相差显微镜下动态观察细胞生长、形态等变化,及定期应用伊红染色、Brdu染色法对所培养生精细胞/支持细胞进行染色鉴定。结果在生精细胞/支持细胞共培养体系中,双室培养2周后,部分生精细胞胞体一端有鞭毛出现,培养4周后,培养体系中仍有一定数量的生精细胞附着在支持细胞上,部分生精细胞上可见鞭毛。单室培养的生精细胞在培养第4-5天开始出现明显脱落,培养1周后大多数生精细胞发生脱落死亡,生精细胞上未见鞭毛出现,但在培养体系中可见次级精母细胞及精子细胞。结论:应用双室培养,生精细胞可存活达一月之久,而且部分生精细胞尾部出现鞭毛,从形态上发生了减数分裂及精子变态过程。三、应用siRNA沉默共培养生精细胞uPAR的基因表达目的利用小分子干扰RNA(siRNA)技术沉默共培养生精细胞uPAR的基因表达,为uPAR在精子发生中的作用研究提供一个很好的研究工具。方法siRNA混合鸡尾酒是根据ShortCut RNAi Kit手册来制备。简单的说,首先通过RT-PCR应用加有T7启动子的特异性引物来合成DNA模板,然后DNA模板通过体外转录过程产生双链RNA,最后通过ShortCut RNaseIII酶消化来制备siRNAs混合物。在培养48小时用Transfect转染试剂分别将15nM、30nM siRNA混合物转染到共培养的生精细胞,48小时应用实时荧光定量RT-PCR方法检测共培养生精细胞uPAR的基因表达。该试验设立两个对照组:空白对照(未加siRNA及转染试剂)及阴性对照组(只加转染试剂,无siRNA)。结果15nM及30nM siRNA转染组uPAR mRNA表达量均明显低于阴性对照组及空白对照组(p<0.05),其中以30nMsiRNA转染组更为明显;相对于阴性对照组,15nM及30nM siRNA转染组uPAR的基因表达抑制率分别为63.5%及76.7%。结论应用ShortCut RNase III法制备的siRNAs鸡尾酒能有效地抑制共培养生精细胞uPAR基因的表达。五、结论在本研究中我们发现uPAR在第一精子发生波中表达最高峰为出生后35天,此时为圆形精子转变为伸长精子,并开始向管腔排放的时期。在我们的共培养体系中,来自20～22天大小的大鼠睾丸组织的生精细胞在培养二周后能分化成精子细胞及变形成为伸长型精子。而这些变化相应于体内uPAR的表达出现高峰期所发生的变化。因此在本培养体系中,应用siRNA沉默uPAR的表达,可以为研究uPAR在精子发生特定时期中的作用及机制提供一个很好的研究工具,如其信号传导通路等。此研究模型的建立也有助于减数分裂及精子变态过程的其它调控因素的研究。