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猪气喘病的病原体是猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)，该病分布广泛，发病率高，自身致死率不高，但由于Mhp能破坏呼吸道黏膜-纤毛屏障，从而继发其他致病菌的感染，导致死亡率提高。此病在世界范围内广泛存在，造成巨大的经济损失。目前国内对本病尚未有较好的血清学检测方法，本试验利用表达纯化的Mhp P46蛋白，初步建立了检测Mhp抗体的间接ELISA检测方法。
1、参考GenBank登录的猪肺炎支原体(Mhp)P46基因序列，利用Primer5.0软件设计合成引物，利用重叠延伸PCR(SOE PCR)对MhpP46基因的三个位点进行定点突变，将Mhp P46基因序列中三个编码Trp的密码子TGA突变为TGG，突变后基因克隆到pMD18-T载体，经PCR和酶切鉴定构建正确的阳性质粒测序，结果表明突变成功。突变后的Mhp P46基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中，构建了重组质粒pET-32a(+)/P46，鉴定成功后，经IPTG诱导，成功地在大肠杆菌Rosetta(DE3)宿主菌中高效表达分子量约为63.5kDa的融合蛋白，并优化了最佳的表达条件。Western blot分析表明该融合蛋白具有反应原性。
2、以纯化后重组融合蛋白为抗原，初步建立了检测Mhp抗体的间接ELISA方法，确定了MhpP46蛋白抗原的最适包被浓度为0.8μg/mL,最适封闭液为5％脱脂乳，检测血清稀释度为1∶20，抗原和抗体的作用时间为30min，HRP-兔抗猪IgG的最适工作浓度为1∶2000，最佳显色时间为15min，确定阴阳性的临界值为0.249，包被的重组蛋白不与猪鼻支原体、猪滑液支原体、猪絮状支原体、猪蓝耳病病毒、副猪嗜血杆菌的阳性血清发生交叉反应，表明建立的ELISA诊断方法具有良好的特异性，批内和批间重复性较好。所建立的ELISA方法与IDEXX ELISA试剂盒的符合率达89.1％。为我国进行Mhp抗体的检测和流行病学调查提供了一种快速简便的血清学方法。