表小檗碱是黄连中的一种重要的异喹啉类生物碱,研究表明表小檗碱具有较强的抗氧化活性,并且能够抑制醛糖还原酶,从而降低血糖,其作用强于小檗碱。与其它生物碱类似,有关表小檗碱的药理作用受到了广泛的关注,具有良好的开发应用前景。近年来有关表小檗碱的药代动力学研究也逐渐受到重视,研究发现表小檗碱在体内外均可发生广泛的代谢,大鼠灌胃表小檗碱后的尿液、粪便和血液,以及表小檗碱的肝微粒体温孵和肠菌孵育样品中均可检出其代谢产物;此外,在体外人肝微粒体温孵体系中表小檗碱对人CYP2D6酶显示较强的抑制作用。但有关表小檗碱体内代谢的部位、代谢途径以及参与其代谢的药代酶等信息目前尚不十分清楚。为进一步阐明表小檗碱的体内药代动力学规律,为表小檗碱的开发利用提供依据,也为黄连配伍机理研究提供实验依据,本课题在已有研究的基础上,结合最近中药药代动力学研究中涌现的新技术和新方法,对表小檗碱开展了以下几方面的药代动力学探索研究:1.建立LC-MS/MS方法,比较灌胃和静注给药表小檗碱后大鼠体内代谢产物的差异,鉴定表小檗碱在肝微粒体中的I相和II相代谢产物,及体外肠菌培养模型中的代谢产物,以确定表小檗碱在体内的代谢部位和代谢途径;2.采用化学抑制剂试验和重组人源CYP450酶筛选实验相结合的方法鉴定人肝微粒体(HLM)和大鼠肝微粒体(RLM)中参与表小檗碱代谢的CYP450酶的亚型;3.采用大鼠体内灌胃诱导,cocktail探针底物肝微粒体体外温孵法考察表小檗碱对主要肝药酶亚型活性的影响;并研究体外不同浓度表小檗碱对CYP2D6酶的抑制作用。现将整篇论文完成过程简述如下:第一部分文献综述此部分对黄连以及黄连中的重要生物碱表小檗碱的研究进展,药物代谢研究方法,代谢酶介导的药物相互作用进行分析、概括和总结。第二部分实验研究1 LC-MS/MS鉴定表小檗碱体内体外主要代谢产物1.1灌胃和静注给药表小檗碱后大鼠体内代谢产物的比较本部分实验采用LC-MS/MS,比较灌胃和静注给药表小檗碱后大鼠体内代谢产物的差异。首先收集空白大鼠尿液、粪便、胆汁及血液,然后灌胃给药表小檗碱50mg·kg-1后将大鼠放入代谢笼中收集尿液、粪便,胆管插管收集胆汁及颈动脉插管收集血液。在正离子检测模式下,将给药后样品与空白样品一级全扫描质谱对比分析,寻找原药可能的I、II相代谢产物,然后对这些代谢产物的分子离子进行多级质谱分析,并结合药物在生物体内的代谢规律,阐述各代谢产物的结构。在灌胃给药大鼠尿液中鉴定出原药及12个代谢产物,粪便中鉴定出原药及4个代谢产物,胆汁中鉴定出原药及3个代谢产物,血液中鉴定出原药及3个代谢产物。在静注给药大鼠尿液中鉴定出原药及12个代谢产物,粪便中鉴定出原药及4个代谢产物,胆汁中鉴定出原药及3个代谢产物,血液中仅鉴定出原型。表小檗碱进入体内后部分以原药直接从大鼠尿液和粪便中排出,在大鼠体内的发生的I相生物转化主要是去甲基(代谢产物III、IV)、二去甲基(代谢产物II),还原反应(代谢产物V)和氧化反应(代谢产物VI),II相生物转化主要是葡萄糖轭合反应(代谢产物VII~XIII)。灌胃和静注表小檗碱后大鼠体内代谢产物基本相同,推测表小檗碱在胃肠道可能较少代谢,代谢转化主要发生在吸收入血后环节,肝脏是其重要的代谢器官。1.2表小檗碱在肝脏中I相代谢产物的鉴定为了研究表小檗碱在肝脏中的I相代谢产物,我们设计了肝微粒体体外温孵实验。大鼠灌胃50mg·kg-1的表小檗碱后,主要有5个I相代谢产物,分别是代谢产物Ⅱ~Ⅵ。对于表小檗碱经人体肝药酶的代谢,我们从HLM进行了考察,仅得到2个代谢产物Ⅲ和IV。从大鼠的肝脏组织制备的微粒体,在体外与表小檗碱共孵育,所得结果与HLM温孵结果相似。因此我们认为,在肝微粒体体外代谢模型中,我们能够检测到的表小檗碱的主要I相代谢产物为Ⅲ和Ⅳ。1.3表小檗碱在肝脏中Ⅱ相代谢产物的鉴定在表小檗碱体外HLM温孵体系中,我们共鉴定出3个Ⅱ相代谢产物,其分别为代谢产物Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ。自大鼠的肝脏组织制备的微粒体温孵体系中的代谢产物,与HLM温孵结果相似。1.4表小檗碱在体外肠菌培养模型中代谢产物的鉴定通过体外肠菌培养模型,我们研究了表小檗碱经肠道菌群代谢后的代谢产物,仅鉴定出1个代谢产物,其为代谢产物Ⅲ。灌胃和静注表小檗碱产生基本相同的代谢产物,由此我们推测表小檗碱在胃肠道发生代谢的可能性较小,代谢转化主要发生在吸收入血后环节。经体外肝微粒体温孵模型和肠菌培养模型中的代谢产物研究,我们进一步证实了上述推测。肝脏是表小檗碱的重要代谢器官,主要发生Ⅰ相脱甲基及Ⅱ相葡萄糖结合反应,而胃肠道和肝外代谢也是表小檗碱的代谢途径。这为进一步研究表小檗碱的生物代谢转化过程提供了科学依据。2表小檗碱CYP450代谢酶亚型的鉴定为了进一步考察负责代谢表小檗碱的肝脏CYP450酶的亚型,我们采用将表小檗碱与8种特异性化学抑制剂分别共孵育的方法,分别鉴定了 HLM和RLM中参与表小檗碱代谢的CYP450亚酶,并结合重组人源CYP450酶筛选实验对化学抑制剂试验的鉴定结果进行验证。化学抑制剂试验是通过比较加入化学抑制剂前后表小檗碱代谢产物生成量的变化,筛选负责代谢表小檗碱的CYP450酶亚型。实验结果表明:在RLM中,CYP3A的抑制剂酮康唑和CYP2D的抑制剂奎尼丁均可较大程度的影响表小檗碱的代谢产物Ⅲ和Ⅳ的生成,说明CYP3A和CYP2D是表小檗碱的代谢酶。在HLM中,奎尼丁、酮康唑抑制代谢产物Ⅲ的生成,而奎尼丁、酮康唑、氯美噻唑均抑制代谢产物IV的生成,说明CYP2D6,3A4,2E1为表小檗碱的代谢酶。重组人源P450酶筛选实验是将人重组酶CYP3A4,2D6,2E1,2A6分别与表小檗碱共温孵,以代谢产物Ⅲ和Ⅳ的生成率为考察指标,在重组酶系统中筛选代谢表小檗碱的阳性代谢酶。实验结果表明:代谢产物Ⅲ的生成主要由CYP2D6,3A4催化,代谢产物Ⅳ的生成主要由CYP2D6,3A4,2E1催化,说明CYP2D6,3A4,2E1为表小檗碱的代谢酶,其贡献值大小为CYP2D6>3A4>2E1。3表小檗碱对大鼠P450酶活性影响的体内外研究本部分实验首先采用大鼠体内灌胃诱导,cocktail CYP450亚酶探针底物肝微粒体体外温孵法,通过HPLC同时检测肝微粒体中5种探针底物的浓度,以探针底物的代谢消除百分率来评价表小檗碱对大鼠肝微粒体CYP450亚酶活性的影响。实验结果显示:与空白对照组比较,给药组可明显抑制CYP2D6的活性(P<0.01),对CYP3A4也有一定的抑制作用(P<0.05),但是对CYP2E1,CYPIA2及CYP2C9未有明显作用,这为明确表小檗碱体内相互作用信息提供了实验依据。体外实验部分采用cocktail探针药物法同时测定5种探针底物的含量,评价体外不同浓度表小檗碱对大鼠肝微粒体CYP450不同亚酶活性的影响。实验结果显示:表小檗碱在体外对大鼠肝微粒体中的CYP2D6酶具有较强的抑制作用,其IC50为35.22μmol·L-1。第三部分讨论和结论本部分对实验研究中各部分结果进行分析、总结和讨论,综合本课题各部分研究成果得出结论:表小檗碱在体内发生了广泛的生物代谢反应,代谢转化主要发生在吸收入血后的环节。肝脏是其重要的代谢器官,主要发生Ⅰ相脱甲基及Ⅱ相葡萄糖结合反应。而胃肠道和肝外代谢也是表小檗碱的代谢途径。介导表小檗碱代谢反应的主要I相肝药酶为CYP2D6和CYP3A4。表小檗碱在体内主要是通过抑制CYP2D6和CYP3A4的活性而与其他药物产生相互作用,而在体外主要抑制CYP2D6的活性。