近年来组织工程化技术在口腔医学领域应用广泛,组织工程化技术的关键是实现细胞的3D培养。相较于培养皿等2D环境,细胞在3D支架中的生长持续时间更长,更能接近体内真实的生长情况,最终实现组织、器官的体外构建。本文利用牛脱细胞真皮基质与Matrigel两种生物支架材料实现HGF(Human gingival fibroblast,人牙龈成纤维细胞)与HOK(Human oral keratinocytes,人口腔角质形成细胞)的3D共培养,体外构建稳定的3D OMM(Three-dimensional oral mucosal model,三维口腔黏膜组织模型)。目的:通过对比两种生物支架材料的细胞3D培养效果,实现HGF与HOK的3D共培养,体外构建稳定的、均一的3D OMM。为临床及实验研究方面的应用提供基础。方法:DispaseⅡ酶分离法结合组织块法培养原代HGF,利用SV40-T(Similar vacuolating virus,猴空泡病毒40-T)抗原慢病毒载体和hTERT(Human telomerase reverse transcriptase,人端粒酶反转录酶)重组慢病毒载体实现HOK的永生化诱导。利用HE(Hematoxylin-Eosin,苏木精-伊红)染色及Vimentin/CK13(cytokeratin 13,细胞角蛋白13)免疫荧光染色完成HGF与HOK的细胞鉴定。将HGF种植于牛脱细胞真皮基质与Matrigel两种生物支架材料上培养7d,构建组织工程化结缔组织模型,通过石蜡切片及HE、DAPI(4-6-diamidino-2-phenylindole4,6-联脒-2-苯基吲哚)染色观察HGF在两种支架材料上的3D生长情况。通过设计出与包埋盒内部空间形态一致的基质胶3D培养组织粘附玻片,并改良常规石蜡切片制作步骤,解决Matrigel支架材料制作石蜡切片难的问题。进而将HGF种植于两种支架材料3D培养7d,形成组织工程化结缔组织,将HOK种植于结缔组织上继续培养7d形成上皮层,置于气-液平面培养7d后,利用针对Matrigel支架材料的改良石蜡切片法完成3D OMM的石蜡切片制作。通过HE及免疫荧光染色观察两种生物支架材料构建的3D OMM组织结构培养效果。结果:(1)利用DispaseⅡ酶分离法结合组织块法可实现HGF的原代培养,3-6代HGF生长状态良好,传至第8代后,细胞增殖活力下降,细胞形态发生改变。HOK通过永生化诱导,可传至第15代,细胞增殖活力仍然正常,细胞形态稳定,呈互不重叠的单层典型铺路石状排列。在牛脱细胞真皮基质组HGF主要集中于支架表层生长,在支架深层,细胞相对稀少。在Matrigel支架材料组可见蓝染的HGF胞核散在分布于支架全层,细胞相对密集。(2)Matrigel支架材料在常规石蜡切片制作过程中易收缩、卷曲及脱离Transwell 0.4μm微孔膜,甚至发生支架材料的断离、碎裂。冰冻切片法使得Matrigel支架材料内部容易形成冰晶,产生大量空隙,从而失去完整的组织形态,造成支架内部HGF大量流失。利用针对Matrigel支架材料的改良石蜡切片法制作组织切片,胶原支架材料完整连续,无空隙及碎裂,3D结缔组织模型结构完整。(3)在HE及免疫荧光染色下可见,在牛脱细胞真皮基质组,细胞主要集中在支架浅层生长,在支架深层,细胞相对稀少。组织的上皮层和皮下结缔组织层分界不清。对于Matrigel支架材料组,细胞均匀分布于该支架材料全层,表面形成一层连续的带状上皮细胞层,胞核蓝染的成纤维细胞散在地生长于上皮下基质胶内。结论:(1)DispaseⅡ酶分离法结合组织块法能有效地实现HGF原代培养,HOK通过永生化诱导解决了细胞扩增倍数少的问题。(2)相较于传统石蜡切片法和冰冻切片法,针对Matrigel支架材料的改良石蜡切片法更适宜用于Matrigel支架材料的石蜡切片制作。(3)相较于牛脱细胞真皮基质,Matrigel支架材料更适宜于构建3D结缔组织模型和3D OMM。