硫化氢(H2S)是一种具有臭鸡蛋气味的有毒气体，存在于多种生产过程以及自然界中。H2S可以通过抑制呼吸链而影响中枢神经系统与呼吸系统的活动，是工业生产中仅次于CO的第二大杀手。20世纪90年代，研究者发现哺乳动物细胞可以内源产生H2S，提示H2S可能具有一定的生理作用。随着近年来相关研究的逐渐深入，H2S已被认为是继CO和NO之后的第三类气体信号分子。　　在哺乳动物细胞内，H2S主要来源于含硫氨基酸，包括半胱氨酸、甲硫氨酸及胱氨酸，H2S产生过程涉及的酶主要有三个:胱硫醚γ-裂解酶(CSE)、胱硫醚β-合成酶(CBS)与3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-MST)。哺乳动物细胞中H2S的过度产生与积累可能会抑制呼吸，产生毒性作用。哺乳动物细胞为了避免体内积累过多的H2S，通常会通过酶促氧化将内源产生的过量H2S重新氧化为硫代硫酸盐。H2S的氧化过程主要涉及三个酶:硫醌氧化还原酶(SQR)、硫转移酶(RHOD)和过硫化物双加氧酶(PDO)。　　自养细菌中H2S的氧化途径及其在能量代谢中的作用已经得到了较为深入的研究。已报道的SQR主要分布于化能自养菌及光合硫氧化细菌中，可以分为六类。在革兰氏阴性自养细菌中发现了两种类型的PDO，能够催化相同的底物，序列相似性较高，在革兰氏阳性自养细菌中发现另外一类PDO，与革兰氏阴性自养细菌中两类PDO的序列相似性较低，且作用底物不同。本实验室前期研究证实，异养细菌中同样含有SQR、PDO及RHOD的编码基因，而且上述蛋白同样在硫化物的氧化代谢中发挥作用。例如实验室前期发现在异养细菌Cupriavidus pinatubonensis JMP134中，SQR首先氧化硫化物生成多硫化物，多硫化物与GSH发生自发反应生成GSSH，然后PDO氧化GSSH生成亚硫酸盐，生成的亚硫酸盐会与多硫化物发生自发反应生成硫代硫酸盐，RHOD能够加速多硫化物与GSH的反应。　　基于上述研究，推测与哺乳动物细胞内类似,H2S的产生与代谢可能广泛存在于细菌中且具有一定的生理作用。本文首先通过生物信息学手段对已全基因组测序的细菌及古菌中的SQR及PDO进行分析，确定SQR及PDO编码基因广泛存在于不同的细菌与古菌中，也有部分细菌与古菌中不含SQR及PDO编码基因。考虑到自养细菌中H2S的代谢已经研究的较为深入，本文针对异养细菌中H2S的产生及代谢开展了后续研究。具体研究对象为C.pinatubonensis JMP134、Pseudomonas aeruginosa PAO1与Escherichia coli BL21(DE3)，其中E.coli BL21(DE3)基因组中不含SQR及PDO编码基因;C.pinatubonensis JMP134基因组中含SQR及PDO编码基因，且SQR及PDO编码基因位于同一个操纵子上;P.aeruginosa PAO1基因组中含SQR及PDO编码基因，但SQR及PDO编码基因在基因组上相距较远。通过对上述菌株中SQR及PDO编码基因进行敲除、回补、过表达及H2S氧化能力分析，发现异养细菌中SQR及PDO能够代谢自身产生的H2S，因而含有SQR及PDO的菌株在培养过程中并不积累和释放H2S;在混合培养过程中，含有SQR及PDO的菌株能够代谢其他菌株释放的H2S。同时以P.aeruginosa PAO1为代表性菌株，对异养细菌中H2S产生途径进行了研究，确认P.aeruginosa PAO1中既含有催化有机硫化物生成H2S的三个酶CBS、CSE及3-MST，也含有催化无机硫化物生成H2S的业硫酸盐还原酶。经过对P.aeruginosa PAO1中已知的H2S合成与代谢相关基因的顺序敲除，得到如下菌株:H2S代谢相关基因敲除菌株Pa3K（Pa△sqr1△sqr2△pdo）、H2S合成相关基因敲除菌株Pa△H2S（Pa△cbs△cse△mst△cysI）、H2S合成与代谢相关基因敲除菌株Pa7K(△cbs△cse△mst△cysI△sqr1△sqr2△pdo)。Pa7K既不含有H2S生成基因也不含有H2S代谢基因，在丰富培养基LB中的生长并未受到影响，也不向外释放H2S。如果向LB培养基中添加过量的半胱氨酸，Pa7K仍然会产生大量H2S，说明P.aeruginosa PAO1通过有机途径产生H2S的过程比较复杂，除了已报道的合成相关蛋白外，还存在其他未知的可催化H2S产生的酶;在添加过量无机硫源的无机盐培养基中，Pa7K不再产生并积累H2S，说明P.aeruginosa PAO1通过无机硫源产生H2S的途径较为单一，其中关键酶为亚硫酸盐还原酶。　　通过对不同异养细菌中H2S代谢相关基因的比较基因组学分析，发现Cupriavidus necator H16基因组中不含有SQR编码基因sqr，但其在培养过程并不释放H2S。对C.necator H16基因组的进一步分析发现，该菌株含有编码黄素细胞色素硫脱氢酶(FCSD)的fccAB基因。FCSD在光合细菌中有报道，包含一个大的能够结合硫的黄素蛋白亚基(FccB)和一个小的cytochrome c亚基(FccA)，其体外功能与SQR类似，能够氧化硫化物生成零价硫，与SQR不同之处在于，FCSD氧化硫化物过程中生成的电子会传递给cytochrome c。目前关于FCSD是否在体内可以行使与SQR类似的催化硫化物氧化的功能并未确定。本文对C.necator H16中FCSD编码基因进行了敲除、回补、过表达及H2S氧化能力分析，实验结果显示，FCSD能够代谢C.necator H16内源产生的H2S，突变菌株Cn△fccAB丧失了H2S代谢能力并向外释放H2S。在P.aeruginosa PAO1的H2S代谢相关基因敲除菌株Pa3K(Pa△sqr1△sqr2△pdo)中对fccAB过表达，发现FCSD在Pa3K中也具有氧化硫化物的活性，而且与SQR类似，FCSD氧化H2S产生的多硫化物也包含二硫化物和三硫化物。进一步在Pa3K中对fccAB与pdo进行共表达，发现FCSD与PDO能够协同代谢H2S。具体过程为:FCSD氧化H2S生成多硫化物，多硫化物与GSH自发反应生成GSSH，接下来GSSH在PDO的作用下氧化生成亚硫酸盐，生成的亚硫酸盐能够与多硫化物发生反应生成硫代硫酸盐，该途径与C.pinatubonensis JMP134中SQR/PDO氧化硫化物的途径类似，区别在于C.necator H16并不含有加速多硫化物与GSH反应的RHOD。生物信息学分析显示，在已全基因组测序的4929株细菌中，有190个菌株含有FccB，且大部分fccB与fccA在基因组上相邻排列。FccBs可以分为三类，每一类在进化上都是相对保守的。　　P.aeruginosa是一种革兰氏阴性条件致病菌，广泛分布于不同生境之中。P.aeruginosa PAO1基因组中含有cbs、cse、mst、cysI等H2S合成相关基因，以及sqr与pdo等H2S代谢相关基因。为了进一步了解H2S产生与代谢在异养细菌中的生理功能，接下来对P.aeruginosa PAO1及其各突变菌株的几个代表性表型:绿脓菌素的产生、生物膜的形成、运动性、血平板上的菌落形态、鼠李糖脂的产生及致病能力等进行了系统研究。实验结果显示，P.aeruginosa PAO1和H2S代谢相关基因敲除菌株Pa3K(Pa△sqr1△sqr2△pdo)表型基本相同，而H2S合成相关基因敲除菌株Pa△H2S(Pa△cbs△cse△mst△cysI)和H2S合成与代谢相关基因敲除菌株Pa7K(△cbs△cse△mst△cysI△sqr1△sqr△pdo)表型基本相同，说明H2S合成而非H2S的代谢对P.aeruginosa PAO1的各类表型会产生影响。具体而言，P.aeruginosa PAO1内H2S合成相关基因的缺失，严重影响了该菌株绿脓菌素的产生、运动能力、鼠李糖脂的产生等表型，且H2S合成相关基因突变菌株对莴苣叶柄的感染能力显著下降。对P.aeruginosa PAO1及H2S合成相关基因敲除菌株Pa△H2S（Pa△cbs△cse△mst△cysI）进行转录组学分析，结果显示H2S合成相关基因的缺失影响了P.aeruginosa PAO1的群体感应系统，考虑到前述表型多受群体感应系统的调控，推测H2S合成基因的缺失首先导致P.aeruginosa PAO1丧失H2S合成能力，进而影响了菌体内的群体感应系统，导致群体感应系统调控的表型相关基因的表达量发生改变，最终影响了P.aeruginosa PAO1的致病能力。尽管上述研究可以证实H2S在P.aeruginosa PAO1中确实具有重要的生理功能，且其生理功能可能与H2S和群体感应系统间的相互作用有关，但H2S的具体作用仍需进一步研究。