第一部分BBD9对淋巴瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡作用目的：研究BBD9对淋巴瘤细胞生长的影响及诱导凋亡作用。方法：MTT法检测BBD9对多种淋巴瘤细胞株的生长抑制作用,瑞氏染色观察细胞形态学变化,AV-PI染色流式细胞术和DNA ladder方法检测细胞凋亡。结果：BBD9能显著抑制四种淋巴瘤细胞株(Raji, L428, namalwa, Jurkat)细胞的生长。在0-4μg/ml BBD9浓度范围内,随着浓度的升高,各种细胞株的细胞存活率逐步降低。同时,BBD9对四种细胞株的生长抑制作用也呈时间依赖性,同一浓度下,随着药物作用时间的延长,细胞存活率也降低。BBD9作用于Raji,L428,namalwa, Jurkat细胞24h的IC5o分别是：1.5μg／ml、1.89μg／ml、1.83μg／ml、1.59μg／ml。BBD9对2例病人原代细胞也呈现剂量依赖性的生长抑制。其IC50分别为2.09gg／ml,2.43 gg／ml。BBD9虽然对4例正常入骨髓单个核细胞也有抑制作用,但其IC50为3.46μg／ml,抑制作用弱于对淋巴瘤细胞株细胞的作用。细胞形态学观察可见,BBD9处理Raji细胞和L428细胞24h后出现了典型的凋亡细胞形态：核碎裂,核浓缩、凋亡小体。DNA片段检测发现经BBD9处理的Raji、L428细胞出现了典型"DNA梯形条带”,而且随着药物浓度的增加,“DNA梯形条带”也越明显。应用AV-PI染色法经流式细胞仪检测表明,BBD9可以诱导淋巴瘤细胞凋亡。0、1、2、3μg／ml BBD9处理Raji细胞24h后,早期凋亡细胞比例分别为2.87±0.35%、9.36±2.10%、11.69±0.89%、46.96±3.58%；而在L428细胞,相应浓度作用后早期凋亡细胞的比例分别为4.45±0.97%、9.02±0.64%、17.62±2.33%、35.87±4.44%。Western blot检测表明,BBD9能诱导Raji细胞和L428细胞的caspase-3,-8,-9及PARP剪切激活。结论：(1)BBD9能抑制多种淋巴瘤细胞株细胞生长。(2)BBD9能抑制原代淋巴瘤细胞生长,对正常骨髓单个核细胞抑制作用弱。(3)BBD9能诱导淋巴瘤细胞凋亡。第二部分BBD9对淋巴瘤细胞的各种信号通路的影响目的：观察线粒体凋亡通路上各种蛋白的改变,观察PTEN/PI3K/Akt信号传导通路中参与信号传导的各种蛋白的改变,观察NF-κB信号传导通路中参与信号传导的各种蛋白的改变,进一步阐明BBD9抑制淋巴瘤细胞生长的分子机制。方法：western blot法检测BCL-2家族蛋白和IAP家族蛋白表达水平,流式细胞术检测细胞周期。western blot法检测细胞周期调控蛋白,检测PI3K／Akt和NF-KB信号通路上各种蛋白的表达水平。Real-time PCR检测PTEN mRNA及miR-17-5p,miR-20a的表达。免疫荧光检测NF-κB在细胞核、细胞浆中的信号表达。结果：BBD9处理Raji细胞后,抑凋亡蛋白Mcl-1明显下调,BCL-2轻度下调,促凋亡蛋白Bak、Bax和Bim、pBad表达量则有明显升高。BBD9下调IAP家族蛋白,如XIAP、CIAP1和Survivin等的表达。细胞周期分析表明,BBD9使淋巴瘤细胞周期阻滞在G2／M期。2gg／ml BBD9处理Raji细胞0、4、8、12、24 h后,处于G2／M期的细胞分别为8.41±3.62%、11.51±2.44%、17.36±6.11%、23.09±2.40%和25.21±9.04%。细胞周期调控蛋白cyclinA、cyclinB1和CDK1在BBD9处理的Raji细胞出现下调。0-3μg／ml BBD9处理Raji细胞24小时后,总Akt无明显变化,而磷酸化Akt呈下降趋势；BBD9还能下调PI3K蛋白,而PTEN呈现明显上调趋势。1、2、3μg／ml BBD9处理Raji细胞24h后,PTEN mRNA拷贝数比对照组分别增加3.76、7.13和19.75倍。而对PTEN mRNA起负调控作用的microRNA-miR-17-5p、miR-20a出现下调。Western blot检测表明,经1～3μg／ml BBD9处理Raji细胞后,胞浆IκB升高,但pIκB减少,胞核内NF-κB表达呈下调趋势。免疫荧光方法检测结果表明,在BBD9处理前,胞核所在位置红色荧光较强,胞浆所在位置红色荧光较弱,提示胞核内NF-κB表达较高,胞浆内NF-κB表达相对较低。经2μg／ml BBD9处理24h后,胞核内的红色信号减弱,即核内NF-κB表达减少,说明BBD9抑制了NF-κB进入核内。结论：(1)BBD9上调促凋亡蛋白Bak、Bax、pBad和Bim,下调抑凋亡蛋白Mcl-1；同时能下调XIAP, CIAP1和Survivin等IAP家族蛋白；通过下调cyclinA、cyclinB1和CDKl使细胞周期阻滞于G2／M期；通过上述途径诱导细胞凋亡,从而抑制淋巴瘤细胞生长。(2)BBD9可抑制PI3K／Akt信号通路,该通路受阻是BBD9诱导淋巴瘤细胞凋亡的一个重要机制。(3)BBD9可下调miR-17-5p,miR-20a,上调mRNA水平,使PTEN蛋白表达上调,来抑制PI3K／Akt信号通路。(4)BBD9可通过抑制IκB磷酸化,阻止NF-KB与IKB解离而进入核内。NF-κB通路受阻可能是BBD9诱导淋巴瘤细胞凋亡的另一个重要机制。总结：BBD9具有抑制淋巴瘤细胞株及原代细胞生长的作用,并在一定范围内呈时间和剂量依赖性。这种生长抑制作用是通过诱导细胞凋亡来起作用的。在BBD9诱导的淋巴瘤细胞凋亡过程中,促凋亡蛋白Bak、Bax、pBad和Bim上调,而抑凋亡蛋白Mcl-1则下调,并能下调XIAP, CIAP1和Survivin等IAP家族蛋白。BBD9还能通过下调cyclinA、cyclinB1和CDK1使细胞周期阻滞于G2／M期。BBD9在mRNA水平、microRNA水平调控PTEN,从而上调PTEN蛋白的表达,进而抑制PI3K／Akt信号通路。该通路受阻是BBD9诱导淋巴瘤细胞凋亡的一个重要机制。此外,BBD9还可以通过胞浆下调磷酸化IκB,抑制NF-κB进入核内来抑制NF-κB信号通路。该通路受阻可能是BBD9诱导淋巴瘤细胞凋亡的另一个重要机制。