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背景肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)(简称肝癌)大部分患者发现时已是晚期,失去了最佳手术时机,经导管肝动脉化疗栓塞术(TACE)是目前主要方法,但易致肿瘤的复发与转移。原因是化疗导致耐药基因的水平升高,抑癌基因的水平降低,从而导致了肿瘤耐药性的产生。基于与这些致癌属性相关的癌基因而设计的分子靶向药物在肝癌治疗中极具发展前景。研究表明FOX家族可以促进肝癌细胞的增殖,但机制尚不清楚。YAP是Hippo信号转导通路下游的效应因子,是重要的癌基因,YAP与肿瘤细胞的增殖和凋亡具有密切的关系,参与肝癌的形成和发展,前期研究发现FOXP1和YAP在肝癌组织中高表达,FOXP1和Yes-Associated Protein(YAP)分别与HCC的发生发展及预后相关,但是二者在肝癌的发生发展中的关系一直没有探讨。本研究的目的是探讨Hippo-YAP信号通路中肝癌相关癌基因FOXP1和YAP在肝癌细胞增殖中的作用,以及以FOXP1-Hippo-YAP作为干预靶标在肝癌分子靶向治疗中的潜在价值。第一部分Fox P1和YAP基因在肝癌组织及TACE治疗后肝癌组织中的表达目的:用肝癌的基因芯片检测结果筛选差异表达基因,发现Fox P1和YAP两基因在肝癌中的表达情况;经TACE后再手术患者组织中FOXP1和YAP表达水平,观察FOXP1和YAP对肝癌生长能力、侵袭能力、耐药性是否产生影响,二者之间的关系。方法:用免疫组化(IHC)和免疫印迹(WB)检测Fox P1蛋白表达,用q PCR检测Fox P1 m RNA的表达。用realtime q PCR和western blot探讨对20例肝癌组织及癌旁组织和20例经DDP介入治疗再手术的肝癌及癌旁组织中FOXP1和YAP基因表达水平。结果:在肝癌组织中FOXP1m RNA和蛋白表达高于癌旁组织表达,FOXP1在肝癌细胞中的表达与肿瘤大小、血清AFP升高、肿瘤TNM分期显著相关。YAP在肝癌中过表达高达62%,而癌旁组织中YAP表达水平极低(9%),而FOXP1在肝癌中过表达高达70.18%,而癌旁组织中FOXP1表达水平低(34.58%),FOXP1与YAP蛋白在人肝癌组织中表达的平均光密度值散点图显示,两者呈正相关性,并经Pearson相关性分析(r=0.60,P<0.0001)。结论:YAP在肝癌中过表达高达62%,而癌旁组织中YAP表达水平极低(9%),而FOXP1在肝癌中过表达高达70.18%,而癌旁组织中FOXP1表达水平低(34.58%),二者表达异常与肝癌的发生、发展密切相关。FOXP1在肝癌患者中高表达和区域淋巴结转移一样看做为患者预后的判断指标。实验证实在肝癌细胞中抑制内源性YAP和FOXP1表达可以抑制细胞增殖、诱导细胞对化疗药物的敏感性增强、细胞凋亡增多,这表明将FOXP1-Hippo-YAP作为干预靶点具有一定的研究价值。第二部分si RNA敲减YAP基因表达对人肝癌细胞增殖和药效影响目的:研究小片段干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)抑制肝癌细胞株中Yes-Associated Protein(YAP)表达后从而提高肝癌细胞株对阿霉素(adriamycin,ADM)的化疗敏感性。方法:根据YAP基因设计si RNA序列,利用脂质体LipofectamineTM 2000以si RNA转染4株肝癌细胞株PLC/PRF/5、Huh-7、MHCC 97H、MHCC 97L,通过荧光显微镜观察及采用蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测肝癌细胞株中YAP的表达。将细胞以不同浓度的ADM作用后,采用四甲基偶氮唑蓝(methyl thialzolyl tetrazolium,MTT)比色法检测细胞生长的存活率。结果:成功地构建针对YAP的si RNA表达载体。Western blotting法结果显示,肝癌细胞株经特异性si RNA转染后,YAP蛋白的表达受到抑制。RNA干扰(RNA interference,RNAi)能特异、有效地抑制肝癌细胞株中YAP的表达。MTT比色法结果显示,经si RNA作用后肝癌细胞株存活率明显受到抑制。结论:设计合成的si RNA表达载体能有效地抑制YAP肝癌细胞株中的表达,增强其对化疗药物ADM的敏感性。第三部分 YAP抑制剂PPIX对肝癌细胞株MHCC97L和PLC/PRF/5的体外增殖抑制目的:研究YAP蛋白抑制剂原卟啉IX(Protoporphyrin IX,PPIX)在体外对人肝癌细胞系增殖抑制作用,和PPIX与化疗药物联合给药的协同作用;以及PPIX对肿瘤细胞Hippo-YAP信号通路和凋亡相关蛋白的表达和激活的影响。方法:用YAP蛋白抑制剂PPIX,以及PPIX和四种药物(阿霉素,顺铂,氟尿嘧啶和索拉非尼)的联合,在体外处理人肝癌细胞系MHCC97L和PLC/PRF/5,利用Celltiter-Glo方法检测细胞活力,计算不同药物对肿瘤细胞增殖的抑制率,并计算协同系数;用Western blot方法检测YAP抑制剂PPIX和化疗药物的联合给药对人肝癌细胞系Hippo-YAP信号通路和凋亡信号分子表达的影响。结果:10μM的YAP蛋白抑制剂PPIX在体外对两株人肝癌细胞系MHCC97L和PLC/PRF/5的抑制率分别为42.07%和25.17%;当PPIX和顺铂或者氟尿嘧啶进行联合给药时,具有一定的协同作用,而PPIX和阿霉素或者索拉非尼进行联合给药时,主要为相加作用,不具有协同性。PPIX的处理可以下调Fox M1和Fox P1的表达,同时上调自噬相关蛋白Beclin1的表达。结论:YAP蛋白抑制剂PPIX对两株人肝癌细胞系MHCC97L和PLC/PRF/5都具有一定的体外增殖抑制效果;PPIX和四种药物联合使用,在体外能够抑制MHCC97L和PLC/PRF/5的增殖,并且具有不同程度的协同性;PPIX在体外作用于MHCC97L和PLC/PRF/5,能够抑制Fox M1和Fox P1的蛋白含量;PPIX和四种药物在体外作用于MHCC97L和PLC/PRF/5,能够上调自噬基因Beclin1的蛋白含量。第四部分YAP抑制剂PPIX对人肝癌细胞株MHCC97L和PLC/PRF/5荷瘤鼠体内药效评价目的:建立人肝癌细胞系MHCC97L和PLC/PRF/5的体内移植瘤模型,评价YAP抑制剂PPIX单独治疗、以及PPIX和阿霉素或者顺铂联合,对肿瘤体内生长的抑制作用。方法:体外扩大培养人肝癌细胞系MHCC97L和PLC/PRF/5,并接种裸小鼠体内,建立皮下移植瘤模型;当肿瘤生长后,进行分组给药,评价YAP蛋白抑制剂PPIX第三部分对肿瘤体内生长的抑制作用,以及PPIX和两个化疗药物(阿霉素和顺铂)的联合治疗药效。结果:在MHCC97L细胞的皮下移植肿瘤中,10 mg/kg的PPIX的单独药物治疗无明显抑制作用;两个化疗药物顺铂和阿霉素,其单独药物治疗不能有效抑制MHCC97L移植瘤的生长;而PPIX和顺铂或者阿霉素的联合给药,也没有明显的肿瘤生长抑制作用。在PLC/PRF/5皮下移植瘤中,PPIX和两个化疗药物顺铂和阿霉素的单独药物治疗,对肿瘤的生长抑制率(TGI)分别为30.34%,48.20%和66.79%,有一定效果;PPIX和顺铂或者阿霉素的联合给药治疗,对肿瘤的生长抑制率分别为57.46%和65.57%,没有明显联合给药协同作用。其中PPIX单独药物治疗组,以及阿霉素和PPIX联合治疗组中,各有一只荷瘤鼠出现了肿瘤消退的情况。结论:YAP蛋白抑制剂PPIX进行体内给药,10 mg/kg给药剂量对MHCC97L皮下移植肿瘤无明显抑制效果;YAP蛋白抑制剂PPIX进行体内给药,10 mg/kg给药剂量PLC/PRF/5皮下移植肿瘤具有一定体内药效,同时导致部分肿瘤生长消退。