研究背景和目的： 急性脊髓损伤(Actlte spinal cord injury，ASCI)仍然是严重危害人类健康的常见疾病。现代社会的交通运输业、建筑业、体育运动等发展迅速，因此而导致的急性脊髓损伤病例也随之增多。仅美国每年新发脊髓损伤病例就有大约11000例，每百万人口里有40例。据估计我国每年约有50000人发病，呈10﹪的上升趋势。脊髓损伤一旦发生，视伤时轻重不同，将导致患者不同程度的肢体残疾。除了给患者本身带来巨大的痛苦，加重社会及康复机构人力、物力及财力的负担，脊髓损伤还增加了患者、家庭以及朋友的心理负担。 急性脊髓损伤至今仍缺乏行之有效的治疗措施。ASCI的治疗仍然是医学研究的一大难题。新千年的第一个十年(2001-2010)被称为“脊柱十年”，目的在于深化我们对于脊柱疾病，包括脊髓损伤，的认识并提高治疗效果。在众多治疗措施中，药物治疗仍然是目前ASCI的研究热点之一。近年来，促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)引起了国内外学者的广泛关注。 长期以来，人们认为EPO作为一种激素，仅仅作用于红骨髓，促进红系造血祖细胞增殖、分化。重组人红细胞生成素(Recombinant human erythropoietin，rHlJEPO)被广泛应用于治疗肾功能衰竭、HIV感染、癌症和外科手术等引起的贫血。但近十余年的报道提示，EPO是多效应的细胞因子，对多种组织起到保护作用，如心肌细胞、毛细血管内皮细胞、肾脏管状上皮细胞以及中枢神经系统(Central nervous system，CNS)等。 EPO的神经保护功效已经在多种动物的多种CNS疾病模型中得到验证。如脑缺血模型、蛛网膜下腔血肿模型、实验性自身免疫性脑脊髓炎模型及脊髓损伤模型等。其中，EPO用于脊髓损伤的研究相对较少，多集中于近4-5年，且给药时间多为损伤后短时间内给药。而Rrines等认为rHuEPO在脑缺血的治疗上存在时间窗。我们认为rHuEPO在用于ASCI也同样存在一定的时间窗。本课题拟分两部分研究rHuEPO对大鼠急性脊髓损伤后的神经功能保护作用。 第一部分：在大鼠脊髓损伤后分不同时间给予一定量rHuEPO，通过观察脊髓损伤后神经细胞凋亡情况及BBB运动评分，以此对于rHuEPO治疗ASCI的时间窗进行初步的研究。为进一步实验及临床研究rHuEPO的时间窗提供一定的理论依据和技术方法。 第二部分：根据第一部分实验结果，选取最佳给药时间，给予一定量rHuEPO，通过行为学观察和组织病理学观察指标来研究rHuEPO治疗大鼠急性脊髓损伤的长期效果。 第一部分大鼠脊髓损伤后不同时间注射重组人红细胞生成素对运动功能及神经细胞凋亡的影响研究方法40只雌性大鼠脊髓血管夹夹伤模型(aneurysm clip model)成功后，随机均分为5组，每组8只。A组(即刻给药组)：大鼠脊髓损伤(SCI)后立即腹腔注射rHuEPO(5000IU/Kg/Bw)；B组(1小时给药组)；C组(3小时给药组)；D组(6小时给药组)；E组(对照组)：SCI后立即腹腔注射等量生理盐水。各组大鼠术后第1、3、5、7d进行BBB运动学评分。选取术后第3天和第7天为取材时问点，各组每时间点各取4只。行TUNEL染色和caspase-3免疫组化染色，观察各组在术后第3天和第7天脊髓神经细胞凋亡的表现。 结果 总体上EPO各给药组的BBB评分较对照组高。但不同给药组之间出现了一定差异。第3天6h给药组的BBB评分和对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。 而第7天的时候，虽然6h给药组的评分高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，但是与即刻给药组、1h给药组和3h给药组相比，6h给药组的评分较低，且差异有统计学意义(P<0.01)。 TUNEL染色结果显示在伤后第3天和第7天这两个时间点上，给药的四组凋亡细胞数均较对照组为少，差异有统计学意义(P<0.01)。但在伤后第3天，可以看出6h给药组凋亡细胞数比1h给药组的多，且差异存在统计学意义(P<0.05)。在伤后第7天，立即给药组、1h给药组和3h给药组的凋亡细胞数比6h给药组的少，且差异有统计学意义(P<0.05)。其中立即给药组和3h给药组的凋亡细胞数比6h给药组的少，差异存在显著统计学意义(P<0.01)。Caspase-3免疫组合染色结果显示各治疗组均较对照组的凋亡细胞阳性率为低，且差异有统计学意义(F<0.01)。但在伤后第3天，6h给药组的凋亡细胞阳性率较即刻给药组、1h给药组和3h给药组的高，且差异有统计学意义(P<0.05)。其中，6h给药组的凋亡细胞阳性率与即刻给药组和3h给药组的差异存在显著统计学意义(P<0.01)。 结论 1．rHuEPO具有神经功能保护功效。可以改善大鼠脊髓损伤后运动功能恢复情况，并抑制伤后脊髓神经细胞凋亡现象的发生。 2．大鼠急性脊髓损伤后3h内给予rHuEPO可显著改善其后肢运动功能并抑制细胞凋亡。而延迟到伤后6h给予rHuEPO，收效甚微。 第二部分重组人红细胞生成素治疗大鼠急性脊髓损伤的实验研究研究方法50只雌性大鼠脊髓血管夹夹伤模型成功后，随机分至3组：rHuEPO组，20只；生理盐水组，20只；假手术组，10只。通过BBB运动评分观察各组大鼠后肢运动功能恢复情况；组织病理学选择HE和抗GFAP、Nogo-A和NelJN免疫组化染色的方法评价rHuEPO对于ASCI的保护及修复作用。 结果 术后第1周开始各观察点上rHuEPO组的BBB评分即高于生理盐水组(P(0.01)。 生理盐水组GFAP的阳性面积明显高于rHuEPO组，且各观察点的差异均存在显著性统计学意义(P(0.01)。而rHuEPO组和假手术组相比，虽然各观察点前者均值均较高，但除了在第6周时差异有统计学意义(P(0.01)，其余观察点两者差异均无统计学意义(P>0.05)。 各观察点上，rHuEPO组的Nogo-A表达光密度均低于生理盐水组，且差异有显著性统计学意义(P(0.01)。 各观察点上，生理盐水组NeuN染色阳性细胞数均明显少于rHuEPO组，差异均存在显著统计学意义(P(0.01)。 结论 大鼠急性脊髓损伤后即刻给予rHuEPO能促进其运动功能的恢复。考虑原因有①抑制脊髓损伤后神经细胞的凋亡；②抑制星形胶质细胞的增生，减少脊髓损伤后损伤局部胶质瘢痕的形成，并且可以抑制神经轴突再生抑制因子Nogo-A的表达，有利于神经轴突再生。