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牛结节性皮肤病（Lumpy Skin Disease,LSD）是由羊痘病毒属（Capripoxvirus,CaPV）牛结节性皮肤病病毒（Lumpy Skin Disease Virus,LSDV）引起的急性、亚急性传染病,特征临床症状为高热,皮肤广泛分布肿块结节。我国于2019年8月在新疆伊犁地区首次确认LSD疫情,目前已在福建、江西等地累计发生24起。LSD已造成严重的经济损失,影响了全球养牛业的健康发展和畜产品的国际贸易,是世界动物卫生组织（OIE）规定必须上报的动物疫病之一。作为一种新发的外来动物疫病,有必要针对LSDV研发快速准确的病原分子检测诊断技术。1.牛结节性皮肤病特异性Cycleave PCR检测方法的建立根据LSDV ORF024基因设计了一对引物和含有RNA碱基的DNA探针,建立了LSDV特异性Cycleave PCR检测方法。该方法特异性良好,不与山羊痘（GTP）、绵羊痘（SPP）、O型/A型口蹄疫（FMD）、蓝舌病（BT）、牛传染性鼻气管炎（IBR）和牛病毒性腹泻-黏膜病（BVD-MD）等传染病病毒的核酸样品反应;最低检测限为1.13 copies/μL;Ct值与100～107 copies/μL拷贝数范围内的LSDV ORF024质粒呈良好线性关系,标准曲线相关系数R2=0.999;批次内与批次间重复性试验结果的变异系数小于2%。利用Cycleave PCR方法检测89份临床样品,检出LSDV核酸阳性53份,阳性检出率比对照的荧光定量PCR方法检测结果高4.49%。以上结果表明,该方法灵敏性高、特异性强,具有可重复性,可为我国牛结节性皮肤病病毒的检测提供技术储备。2.牛结节性皮肤病病毒,山羊痘病毒,绵羊痘病毒三重荧光PCR检测方法的建立根据羊痘病毒属ORF091基因建立了鉴别牛结节性皮肤病病毒（LSDV）、山羊痘病毒（GTPV）和绵羊痘病毒（SPPV）3种病毒的三重TaqMan MGB荧光定量PCR方法。该方法特异性良好,与O型/A型口蹄疫病毒（FMDV）、蓝舌病病毒（BTV）、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（BVDV）和羊口疮病毒（ORFV）的核酸样品无交叉反应;在101～108 copies/μL标准阳性质粒拷贝数范围内有良好的线性关系,标准曲线相关系数R2≥0.998;对LSDV、GTPV、SPPV的最低检测限分别为5.41 copies/μL、27.68 copies/μL、17.28 copies/μL;批次间与批次内变异系数均小于2.5%。应用该方法检测双重或三重模拟混合感染样品,各组分信号良好,无交叉反应,变异系数均小于4%。应用本研究建立的三重qPCR方法和已发表的羊痘病毒属三重qPCR方法检测123份临床样品,检出LSDV核酸阳性53份、GTPV核酸阳性13份和SPPV核酸阳性3份;LSDV阳性率比对照方法检测结果高8.94%,GTPV和SPPV的阳性检出率相同。表明本研究建立的三重荧光定量检测方法敏感、特异,可适用于LSDV、GTPV和SPPV临床样品的检测。3.我国牛结节性皮肤病病毒异源弱毒疫苗山羊痘病毒AV41株基因组分子标记的比较分析为鉴别牛结节性皮肤病病毒野毒株与异源的山羊痘弱毒疫苗株,运用生物信息学方法,将与牛结节性皮肤病病毒同属异源的山羊痘病毒疫苗AV41株基因组全序列,与GenBank数据库中已发表的LSDV、GTPV和SPPV基因组全序列比对,筛选出19个AV41株基因组分子标记。对我国牛结节性皮肤病野毒株LSDV/China/XJ/2019-1,与不同厂家来源的山羊痘疫苗株AV41的分子标记所在序列测序,获得7个AV41基因组独特分子标记,包括 DNA ligase 基因 2433A2434、Kelch-like protein 基因 1831A1832、GTPVgp020 基因 G203A、GTPVgp021 基因 C681T、DNA-binding viron core protein基因 C47T、RNA polymerase subunit 基因 T64C 和 Myristylated protein 基因 C746A。上述分子标记可为我国野毒株LSDV/China/XJ/2019-1与疫苗株GTPV/AV41的鉴别提供分子基础。