人或动物感染H5N1高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)以引发强烈的“细胞因子风暴”为特征。尽管目前H5N1 HPAIV还没有获得在人与人之间高效传播的能力,但由于其可以感染少部分人并具有高致死率,给人类公共卫生安全构成了巨大威胁。PA蛋白是流感病毒聚合酶复合体的第三个蛋白亚基,其在病毒基因组的转录和复制、在致病禽类和哺乳动物、在病毒和宿主的相互作用以及在病毒介导的抑制宿主蛋白合成等方面均起作用。前期研究己明确PA基因所介导的病毒在宿主体内的致死性扩散和产生的强烈的免疫应答水平是H5N1禽流感病毒高致病力的关键。PA-X是由IAV基因组片段3编码的一个约29kD的小蛋白。Jagger等于2012年发现并证实PA-X蛋白能抑制宿主的先天性免疫应答,尤其是显著调节与炎症以及凋亡相关的免疫应答。本室前期研究发现PA-X通过抑制病毒的复制和宿主的免疫应答来减弱病毒对禽类和小鼠的毒力。作为一类重要的转录因子,NF-κB在介导炎症、免疫应答、增殖、凋亡以及在IFN-a/β合成中均发挥着重要作用。然而目前为止,对PA、PA-X蛋白在NF-κB信号转导中的作用还有诸多未知的地方。本研究旨在探索H5N1高致病性禽流感病毒及其PA、PA-X蛋白对NF-kappaB转录活性的影响,并对其机制进行初步分析。1.模式病毒的差异免疫应答及其对NF-κB转录活性的差异分析1996年首次发现于病鹅的H5N1高致病性禽流感病毒已经传播到60多个国家。因此,需要更多地了解流感病毒与其宿主之间的相互作用。前期研究表明,遗传背景高度相似的H5N1毒株会表现出不同的致病表型。CK10和GS10全基因组仅仅差异30个氨基酸。但是CK10表现为对小鼠和麻鸭高致病性,而GS10为低致病性。我们通过比较CK10和GS10感染PBMC和DEF的细胞因子、趋化因子及相关受体的表达水平,发现两者存在显著差异。CK10引起的先天性免疫应答在8hpi和24hpi出现两次较大的峰值,并且此时的病毒滴度水平还较高。相较于GS10,整个感染周期内,强毒株CK10感染后诱导的细胞因子表达是强烈而持久的。作为炎性应答的关键调控者,转录因子NF-κB在流感病毒复制和诱导的免疫反应中的确切机制一直饱受争议。一方面NF-kB活化是流感病毒得以高效复制和传播的前提,阻断通路则影响病毒的增殖。另一方面,NF-κB又能发挥抗病毒作用。因此,我们进一步探讨NF-κB信号转导途径在体外感染细胞的调节机制。通过双荧光素酶报告系统和NF-κB p65活性检测,发现强毒株CK10激活NF-κB的转录水平高于GS10。综上,H5N1高致病性禽流感病毒能激活由NF-κB信号通路调节的炎症反应或免疫应答,而其弱毒株GS10的应答水平较低。2.分析模式病毒PA蛋白对NF-κB转录功能的影响前期研究己表明,PA基因是决定CK10和GS10在小鼠和麻鸭模型上致病力差异的主要分子基础。其互换在很大程度上引起CK10和GS10两者表型的转换,包括病毒的复制能力,聚合酶活性以及刺激宿主先天性免疫应答的能力。此外,近期也有文献报道PA基因在抑制宿主的I型IFN的信号转导上也发挥影响。作为一类重要的转录因子,NF-κB在介导炎症、免疫应答、增殖、凋亡以及在IFN-α/β合成中起着不可或缺的作用。然而,PA在NF-κB信号转导中的确切作用还不是很清楚。我们的研究结果表明,PA可以抑制由Poly(I:C)刺激引起的NF-κB转录,并且强毒株CK10-PA的抑制效果更显著。有趣的是,PA对NF-κB转录的抑制能力与PA的表达量之间不具有明显的剂量依赖关系。我们还发现PA对NF-κB的抑制作用并不是以p65的磷酸化和核转移为特征的。此外,通过测定NF-κB调控的主要基因mRNA的表达水平,我们进一步证实了 PA在抑制NF-κB转录的同时,也抑制其相关基因(尤其是TNF-α Nos2、IL-6和IL-2)的表达。这也说明了 PA参与调节宿主炎症反应、调节信号转导等多方面功能。因此,进一步了解其确切机制可能有助于制定更有效的防控高致病性禽流感的策略。3.鉴定PA基因上影响NF-κB转录差异的关键氨基酸位点PA蛋白是流感病毒聚合酶复合体的第三个蛋白亚基。与另外两个亚基(PB2、PB1)相比,PA蛋白的准确功能还不是很清楚,尤其是其在NF-κB转录过程中的确切作用和机制更不完善。上一章我们已明确PA对NF-κB的转录抑制效果最明显,因此,本章进一步鉴定PA基因上影响NF-κB转录差异的关键位点。CK10和GS10的PA基因共存在8个氨基酸差异(N115S,A127V,E627G,K237E,I353R,D101G,Q259P 和 T404A)。双荧光素酶报告基因结果显示,N115S、A127V和E627K的NF-kB-luc的相对荧光素酶与GS10-PA相比较明显降低,而转染K237E和I353R有所提高。这说明N115S、A127V和E627G是决定PA抑制NF-κB转录的关键分子基础。对于造成NF-κB转录差异的关键氨基酸位点,我们进一步分析了它们对NF-κB调控的靶基因mRNA表达水平的影响。结果显示,PA的这五个关键氨基酸位点(115/127/627/237/353)均抑制了其靶基因的表达。其中,以IL-2、IL-6、TNF-α、Nos2下调趋势最为显著。然而GS10-PA627对NF-κB下游靶基因(尤其是Bcl2、VEGF和Cox2)的抑制效果最弱。提示这些靶基因可能还参与了其他通路或受其他因素的调节。我们进一步研究了模式病毒PA差异氨基酸位点对NF-κB p65活性的影响。研究发现,转染GS10-PA-(N115S/A127V/K237E)后,其核蛋白的NF-κB p65活性急剧提高,与对照组和母本GS10-PA均有显著差异。进一步分析可得,存在差异的氨基酸N115S、A127V和K237E分别位于聚合酶活性聚集区域(92-117氨基酸区域)、NLS1(124-139氨基酸区域)以及NLS2(186-247氨基酸区域)。以上结果充实了我们对模式病毒PA抑制NF-κB转录作用的了解。4.研究PA-X蛋白对NF-κB转录功能的影响2012年,Jagger等在流感病毒的PA基因上发现了一个新的融合蛋白PA-X。它通过核糖体框移码产生于嵌合在PA基因里的+1开放阅读框(ORF),大小约为29kD。其N-末端的191个氨基酸来源于PA的ORF,而其C-末端来自于PA mRNA的第二个开放阅读框(位于PA的190-253位密码子)。前期研究明确了 PA-X通过抑制病毒复制和宿主应答来降低H5N1 HPAIV的致病性。NF-κB在炎性反应和免疫应答中发挥重要作用。然而,PA-X对NF-κB转录功能的影响目前还不清楚,并且其他功能还未知。在本研究中,通过双荧光素酶报告系统,发现PA-X可以抑制由Poly(I:C)刺激引起的NF-κB转录。此外,进一步结合NF-κB p65的活性检测得出,PA-X对Poly(I:C)引起的NF-κB的转录抑制作用不是以降低细胞核中的p65活性为特征的。利用激光共聚焦和WB技术,我们发现PA-X对Poly(I:C)引起的NF-κB p65蛋白的核定位和磷酸化均无明显的抑制作用。通过测定NF-κB调控的主要基因mRNA的表达水平,我们进一步证实了 PA-X在抑制NF-κB转录的同时,也抑制其相关基因的表达,尤其是TNF-α、Nos2、IL-6和IL-2。因此,我们确定了 PA-X在体外转染的细胞中对NF-κB信号通路的影响,继续深入研究PA-X蛋白在免疫应答和信号转导通路方面的作用将为防控H5N1 HPAIV提供新的思路。