研究背景:人类辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology ART)的特点之一就是妊娠率在不同病人之间变化非常大,这种变化很大程度上是由于现在常用的可观测参数无法全面表现出胚胎的发育潜能。形态学一直是评估胚胎最常用也较为稳定的方法,从光学显微镜下获得的关于胚胎的信息虽然已被证实和IVF(In vitro fertilization IVF)的妊娠结局直接相关。但人们发现,即使评分相近的同父母来源的胚胎也可能有完全不同的妊娠结局。这说明胚胎形态并不能完全反应它的种植潜能。胚胎的氧耗量即胚胎的呼吸率,由于线粒体是产生三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate ATP)的主要细胞器,故胚胎的氧耗量与线粒体活动密切相关,测量胚胎的呼吸率可以在一定程度上反应胚胎线粒体的功能。胚胎的线粒体完全来源于卵母细胞,而卵母细胞质量对胚胎活力有很大的影响。呼吸率能够反应胚胎中线粒体的活性,从而间接反应胚胎的活力。胚胎呼吸率测量是一种非侵入性的方法,能够安全快捷测量活胚胎的活力。该方法的基础是胚胎消耗氧离子形成球形阳离子扩散,以精确到纳安级别的铂金微电极测量胚胎周围由于氧的扩散而引起的电流变化,通过电流变化反映胚胎的耗氧量(即胚胎呼吸率)。本文将非侵入性的呼吸率测量结合传统的形态学评分回顾性分析了解冻移植周期(Frozen-thawed embryo transfer FET)胚胎的氧耗量及其临床妊娠结局,观察呼吸率与临床妊娠结局之间的关系。目的:使用细胞呼吸率测量系统测量胚胎呼吸率,随访移植后病人胚胎着床情况及妊娠结局,探讨胚胎呼吸率测量能否反应胚胎发育潜能。研究对象和方法:1.入组标准及分组实验共分为三部分进行,第一部分为FET周期双胚胎移植组。该组选择FET周期患者,研究人群为:女方年龄≤35岁,排除遗传性疾病,合并卵巢和输卵管因素的不孕以及子宫因素的不孕;无输卵管积液,男方精子正常。胚胎选择IVF授精。胚胎选择基于形态学标准,胚胎质量为优于8细胞3级的可移植胚胎。实验人群按呼吸率分为三组,A组:两枚胚胎呼吸率都达到或高于3.0 fmol/s,B组:移植的两枚胚胎中只有一枚呼吸率达到3.0 fmol/s,C组:两枚胚胎呼吸率均小于3.0 fmol/s。第二部分为FET周期单胚胎移植组,该组患者纳入标准同第一部分,但移植单胚胎。胚胎根据呼吸率分为两组;A组:胚胎呼吸率小于3.0 fmol/s,B组:移植的胚胎呼吸率大于等于3.0 fmol/s。第三部分为Time-Lapse结合呼吸率选择胚胎组。该组患者纳入标准为:年龄≤35岁,月经正常,BMI:18-25,获卵数:5-15枚,采用ICSI(Intracytoplasmic sperm injection ICSI)授精。患者采用标准长方案促排卵,此次治疗为患者的首次助孕。不孕因素为单纯输卵管不孕,排除遗传性疾病,合并卵巢和输卵管因素的不孕和子宫因素的不孕。胚胎质量为优于8细胞的3级可移植胚胎。。实验分为三组,A组为形态学选择二细胞开始时间T2cb<26.725 h的胚胎,B组为呼吸率大于等于3.0 fmol/s的胚胎,C组为同时满足T2cb<26.725 h和呼吸率大于等于3.0 fmol/s的胚胎。三个部分的患者的胚胎呼吸率测量均于移植前进行2.研究方法(1)纳入标准的患者于周期前签署呼吸率测量相关的知情同意书。(2)于移植前进行呼吸率测量,采用SECM进行呼吸率的测量,测量方法为:1.将移植前的胚胎置于充满人输卵管缓冲液的测量槽内。测量槽为上宽下窄的圆锥形,胚胎自然沉积到底部。2.随着胚胎代谢耗氧,缓冲液顶部至底部出现递减的氧浓度差。3.调节参数后,将特殊的微电极沿垂直方向自上而下地扫描缓冲液内的电位差。在系统内转化为胚胎的呼吸率。4.记录各枚胚胎的呼吸率。全部操作在尽量短的时间内完成。(5)B超监测种植率,电话随访流产率、临床妊娠率、活产率并分析三组之间的差异。结果:FET双胚胎移植组:共测量131个周期,对共262枚胚胎进行了呼吸率测量。比较三组间年龄,BMI,子宫内膜厚度等基本情况,统计并分析了三组间种植率,临床妊娠率,流产率和活胎分娩率等妊娠结局的差异。其中A组共测量83个周期,166枚胚胎,种植率48.19%,妊娠率65.06%,流产率4.82%,活胎分娩率60.24%;B组包含36个周期,72枚胚胎,种植率43.05%,妊娠率58.33%,流产率19.4%,活胎分娩率38.89%;C组有12个周期,共测量24枚胚胎,其中种植率37.5%,妊娠率50%,流产率16.67%,活胎分娩率33.33%。统计学分析发现,三组患者年龄,BMI及子宫内膜厚度等基本情况间不存在统计学差异(P>0.05)。A组拥有更低的流产率及更高的活胎分娩率,且相较于B组和C组存在明显的统计学差异(P<0.05)FET周期单胚胎移植组:共移植58枚胚胎,其中呼吸率大于3.0的23枚,临床妊娠率43.48%。呼吸率小于等于3.0的35枚,临床妊娠率54.29%。两组妊娠率不存在统计学差异,但移植呼吸率大于3.0胚胎组临床妊娠率有所提高。Time-Lapse联合呼吸率组:共移植35枚胚胎,A组单纯形态学选择,移植13枚胚胎,种植率46.15%。B组单纯选择大于3.0胚胎,移植15枚,种植率53.33%。C组呼吸率联合形态学,移植7枚,种植率57.14%。提示满足形态学和呼吸率两个条件的胚胎种植率有所增加,但不存在统计学差异。结论:呼吸率测量在预测胚胎发育潜能方面还存在缺陷,但是当呼吸率大于等于3.0 fmol/s时,胚胎移植后患者的妊娠结局有所改善。提示胚胎呼吸率可以作为胚胎选择的辅助参数。研究背景:造血微环境(hematopoietic inductive microenvironment,HIM)是造血干细胞(Haemopoietic stem cells,HSCs)赖以生长发育和增殖分化的场所【1】,其结构和功能完整是维系正常造血功能的重要因素。造血基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)作为HIM的核心组分,不仅通过形成HSCs生长发育的“龛”、分泌造血生长因子和细胞外基质等方式支持和调控HSCs自我更新与分化,还与多种血液系统疾病的发生、发展和预后密切相关,因此骨髓基质细胞成为研究HIM结构与功能最为重要的研究对象。课题组前期研究证明,随着小鼠年龄增加,其HSCs也随之衰老,最终导致衰老相关性老年疾病的发生。HSCs衰老是否与造血诱导微环境的稳态有关值得思考,本研究采用D-半乳糖(D-galactose,D-gal)建立BMSCs体外和体内衰老模型,探讨D-gal诱导BMSCs衰老可能的生物学机理,为研究HSCs衰老与HIM的关系、寻找延缓HSCs衰老的有效途径奠定理论基础,提供实验室依据。目的:采用致衰剂D-gal构建大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)体外和体内衰老模型,探讨BMSCs衰老生物学特性及其机制。材料与方法:体外对照组:常规培养大鼠骨髓BMSCs,取第三代(Passage3,P3)细胞继续培养48 h;体外衰老组:在对照组基础上加入D-gal(终浓度30 g/L),作用48 h;体内衰老组:大鼠皮下注射D-gal(120 mg/kg.d),qd×42 d;体内对照组:大鼠皮下注射等时等量0.9%Nacl溶液,模型完成第2 d,取骨髓分离培养BMSCs,取P3细胞进行实验。检测指标:CCK-8测定细胞增殖能力;流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡率;β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色观察BMSCs衰老百分率;DCFH-DA荧光流式细胞术检测细胞活性氧簇(ROS)水平;酶学法检测过氧化物丙二醛(MDA)含量和总超氧化物歧化酶(SOD)活性;Western blotting检测P16、P21、P53、CDK2和cyclin-D表达。结果:D-gal在体外与体内均能建立BMSCs致衰老模型。表现在:1.BMSCs增殖能力下降;细胞G0/G1期比例增高、S期比例降低(P<0.05);2.SA-β-Gal染色阳性的BMSCs百分率上升(P<0.05);3.胞内ROS、MDA上升,SOD下降(P<0.05);4.BMSCs的P16、P21、P53表达上调,CDK2、cyclin-D下调(P<0.05)。结论:D-Gal在体内与体外均能构建BMSCs衰老模型,其机制可能与D-gal诱导BMSCs氧化损伤和激活衰老信号途径相关。