第一部分:乳鼠窦房结细胞和心室肌细胞的提取及其电生理特点的比较目的:对乳鼠窦房结细胞和心室肌细胞进行分离培养,膜片钳记录乳鼠窦房结细胞和心室肌细胞起搏电流(If)和动作电位并比较其特点,运用实时定量聚合酶链式反应(PCR)分析乳鼠心室肌If基因的表达。方法:通过酶消化法分离乳鼠窦房结细胞和心室肌细胞,其中窦房结组织取自界嵴中部静脉窦侧、前腔静脉根部,心室肌细胞取自乳鼠心室。用光镜、膜片钳记录动作电位等方法鉴定窦房结细胞和心肌细胞;用全细胞膜片钳技术记录乳鼠窦房结细胞和乳鼠心肌细胞的If并研究其特性;采用实时定量PCR技术检测乳鼠窦房结细胞和乳鼠心室肌细胞If基因即超极化激活的环核苷酸门控通道(m HCN)亚型1、2和4的表达。结果:(1)通过酶消化法分离乳鼠窦房结细胞和心室肌细胞,用光镜、膜片钳记录动作电位等方法鉴定;(2)培养3~5天,光镜下可观察到搏动更快的梭形细胞,膜片钳记录动作电位频率为174.4±14.6bpm(n=20),证实为窦房结细胞。观察到自发搏动频率较慢的多角形细胞,膜片钳记录动作电位频率为69.7±10.1bpm(n=20),证实为心室肌细胞。全细胞膜片钳记录到乳鼠窦房结细胞和心室肌细胞的If,并分别得到电流-时间曲线,窦房结细胞If电流的半最大激活电位约为-77.74m V,而乳鼠心室肌细胞If电流的半最大激活电位-93.58m V,窦房结细胞自律性显著高于乳鼠心室肌细胞。实时定量PCR检测,乳鼠窦房结细胞的m HCN1:m HCN2:m HCN4为(4.16±0.19):(0.03±0.19):1,以m HCN4和m HCN1为主;乳鼠心室肌细胞的m HCN2:m HCN4为(4.62±0.23):1,未检测到m HCN1表达。结论:乳鼠窦房结细胞和心室肌细胞均有超极化激活的If电流,二者均表达HCN基因,窦房结细胞的自律性显著高于乳鼠心室肌细胞,窦房结细胞主要表达m HCN4和m HCN1,心室肌细胞主要表达m HCN2和m HCN4,二者表达HCN基因亚型的差异可能是影响其自律性的重要因素之一。第二部分:慢病毒介导h HCN4转染骨髓间充质干细胞构建生物起搏模型目的:研究超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型4(h HCN4)转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),与乳鼠心肌细胞共培养构建心脏生物起搏器模型的可行性。方法:构建包含h HCN4基因和绿色荧光蛋白的穿梭质粒p CDH-GFP-h HCN4,并通过四质粒系统包装成慢病毒颗粒Lenti V-GFP-h HCN4,转染大鼠的MSCs,构建成h HCN4+MSCs;将仅有GFP基因的慢病毒颗粒Lenti V-GFP的MSCs设为对照组h HCN4-MSCs。通过荧光显微镜、RT-PCR以及Western-blot观察鉴定h HCN4基因在MSCs中的表达;Puro筛选转染了h HCN4基因的MSC,获得稳定表达h HCN4的MSCs细胞株,膜片钳记录阳性转染细胞的起搏电流If。将各组MSCs与乳鼠心室肌细胞共培养构建心脏生物起搏器模型,计数心室肌细胞自发搏动频率、记录自发性动作电位;加入缝隙连接阻断剂甘珀酸观察阻断缝隙链接后乳鼠心肌细胞自发搏动频率的变化。结果:通过酶切电泳以及基因测序证明包含目的基因h HCN4的穿梭质粒p CDH1-GFP-h HCN4构建成功;通过四质粒系统包装成慢病毒颗粒Lenti V-GFP-h HCN4。通过慢病毒载体介导h HCN4基因转染MSCs,转染7天后,荧光、RT-PCR以及western blot证实h HCN4+MSCs中有h HCN4基因的表达;膜片钳记录到h HCN4+MSCs上有时间和电压依赖性的超极化激活的内向电流,该电流符合If的特征,证明MSCs上已经成功表达了有功能的起搏离子通道h HCN4。将h HCN4+MSCs与乳鼠心肌细胞共培养后,发现实验组心肌细胞的自发搏动频率明显快于对照组中的心肌细胞自发搏动频率。膜片钳结果显示心肌细胞的自发动作电位频率显著提高(70.5±8.2bpm vs.98.1±11.2bpm,P<0.05,n=10);动作电位频率变规则;动作电位最大舒张电位(MDP)绝对值降低(-84±4m V vs.-76±3m V,P<0.05,n=10)。加入甘珀酸后实验组乳鼠心肌细胞自发搏动频率明显下降。结论:h HCN4基因改造的MSCs可表达h HCN4基因,超极化下产生If电流;与心室肌细胞共培养,成功构建成具有自律性的心脏生物起搏器模型。第三部分:共转染h HCN4和h HCN1改良生物起搏细胞目的:研究共转染h HCN4和h HCN1基因构建的生物起搏模型是否具有更高的生物起搏效率。方法:构建包含h HCN1基因和红色荧光蛋白的穿梭质粒p CDH-RFP-h HCN1,并通过四质粒系统包装成慢病毒颗粒Lenti V-RFP-h HCN1。以Lenti V-RFP-h HCN1转染稳定表达h HCN4的MSCs,获得共转染h HCN4和h HCN1基因的MSCs。同时以Lenti V-RFP-h HCN1转染未经基因修饰的MSCs,以puro筛选,获得稳定表达h HCN1基因的MSCs。通过荧光显微镜、RT-PCR以及Western-blot观察鉴定h HCN4基因在MSCs中的表达。膜片钳检测各组MSC上If电流。将各组MSCs与乳鼠心室肌细胞共培养构建心脏生物起搏器模型,计数心室肌细胞自发搏动频率,记录自发性动作电位,记录各组MSCs的If电流;加入缝隙连接阻断剂甘珀酸观察阻断缝隙链接后乳鼠心肌细胞自发搏动频率的变化。结果:通过酶切电泳以及基因测序证明包含目的基因h HCN1的穿梭质粒p CDH1-RFP-HCN4构建成功;包装慢病毒颗粒Lenti V-RFP-h HCN1。分别以慢病毒Lenti V-RFP-h HCN1转染h HCN4+MSCs和未经基因修饰的MSCs,获得共转染h HCN4和h HCN1基因的MSCs(HCN1+4组),仅转染h HCN1基因的MSCs(HCN1组),第二部分中得到的稳定转染h HCN4基因的MSCs为HCN4组,以及未行基因修饰的MSCs(对照组)。荧光、PCR以及western blot证实了HCN1+4组和HCN4组有h HCN4基因的表达,HCN1+4组以及HCN1组有h HCN1基因的表达。在HCN4组、HCN1组以及HCN1+4组都可记录到明显的电压与时间依赖性的超极化内向电流,对照组无相应电流表达。将各组MSCs与乳鼠心肌细胞共培养,HCN1+4组乳鼠心肌细胞自发搏动频率(138.1±11.5bpm)较HCN1组(96.3±7.5bpm)和HCN4组(99.1±8.7bpm)均更高(p<0.05,n=10),HCN1+4组的最大复极电位(-69.6±3.7m V)较HCN1组(-75.9±5.2m V)和HCN4组(-75.2±1.9m V)均更低,HCN1+4组4期自动去极化速率(55.2±8.9 m V/s)较HCN1组(33.4±2.4 m V/s)和HCN4组(33.8±5.3 m V/s)更快。加入甘珀酸后,三组乳鼠心肌细胞的自发搏动频率均明显减慢。结论:与单独转染hHCN1或hHCN4基因相比,共转染hHCN1和hHCN4构建的生物起搏器模型具有更高的自律性。第四部分:共转染h HCN1和h HCN4后If电流的电生理特点及其提高生物起搏模型自律性的机制目的:全细胞膜片钳技术记录稳定共转染h HCN1和h HCN4基因的MSCs,并与h HCN1组和h HCN4组进行比较,比较各组If电流的特点,探讨共转染h HCN1和h HCN4基因改善生物起搏模型自律性的机制。方法:全细胞膜片钳技术记录稳定转染h HCN1基因、h HCN4基因以及共转染h HCN1和h HCN4基因的MSCs,观察If电流时间曲线,电压依赖性稳态激活曲线以及通道激活时间常数曲线,比较各组间If电流密度的差异。以c AMP、Cs+、以及伊伐布雷定分别灌流,观察它们对各组If电流的影响。结果:各组稳定转染的MSCs均可记录到一系列超极化内向离子流(If电流),各组电流均成电压时间依赖性。Ih HCN1半最大激活电位V1/2为-92.27±0.53m V;Ih HCN4半最大激活电位V1/2为-102.09±0.72m V;Ih HCN1+4半最大激活电位V1/2为-90.88±0.48m V。Ih HCN4半最大激活电位电位显著较Ih HCN1和Ih HCN1+4更负。测试电位-90m V时,Ih HCN1电流密度为-11.6±6.01p A/p F,Ih HCN4电流密度为-20.5±5.46p A/p F,Ih HCN1+4电流密度为-59.9±8.02p A/p F,Ih HCN1+4电流密度最高,Ih HCN4次之,Ih HCN1最低。三组间的差异具有统计学意义(n=10,p<0.05)。测试电位-90m V时,Ih HCN1激活时间为150±27.31ms,Ih HCN4激活时间为920±86.9ms,Ih HCN1+4激活时间为140±18.02ms,Ih HCN4激活时间要显著长于Ih HCN1和Ih HCN1+4(n=10,p<0.05),而Ih HCN1和Ih HCN1+4激活时间的差异无统计学意义(n=10,p>0.05)。电极内液中加入终浓度为100μmol/L的c AMP后,Ih HCN1+4的V1/2从加c AMP前的-90.88±0.48m V,向正向移动至-83.39±0.20m V,正向移动约11m V(n=10,p<0.05);c AMP使Ih HCN1+4激活明显加快,测试电压-90m V时,加入c AMP前Ih HCN1+4的激活时间为140±18.02ms,加入c AMP后,Ih HCN1+4的激活时间缩短为84±14.42ms(n=10,p<0.05)。Cs+可阻断If,其Ih HCN1+4对半效抑制浓度为125.8±14.9μmol/L,4mmol/L Cs+对Ih HCN1+4的抑制在洗脱后可部分恢复。伊伐布雷定可抑制Ih HCN1+4,IC50为1.07±0.039μmol/L,5μmol/L伊伐布雷定对Ih HCN1+4的抑制在洗脱后可完全恢复。结论:共转染了h HCN1和h HCN4基因的MSCs,其表达的Ih HCN1+4电流密度较Ih HCN4和Ih HCN1+4更高,激活速度较Ih HCN4更快,和Ih HCN1相当。构建的生物起搏细胞可被神经体液因素调控,c AMP可加速其激活,Cs+以及伊伐布雷定可阻断。这些实验结果为h HCN1和h HCN4共转染改良生物起搏模型提供了理论依据,为将来生物起搏细胞运用于临床奠定了基础。