论文部分内容阅读
杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）与嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是海洋与湖泊生态系统中鱼类的主要致病菌,可引发鱼类患疖疮病和出血性败血症甚至死亡,同时也能通过水源、食物使人类患病。因此,建立快速检测水体中这两种致病菌的技术与方法对水产养殖及公共健康安全具有非常重要的意义。适配体是利用指数富集的配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）获得的一段单链DNA（Single-stranded DNA,ssDNA）或RNA序列。适配体具有高特异性、高亲和力、稳定性强等优点,在疾病诊断、生物传感以及靶向治疗等领域得到了广泛应用。类石墨相氮化碳（Graphene-like carbon nitride,g-C3N4）是一种新型的高分子纳米材料,因其持续发光、无毒、优良的生物相容和吸附ssDNA等优势,在生物传感和生物成像等领域显示出巨大的应用潜力。本论文以杀鲑气单胞菌作为靶标,利用Cell-SELEX得到其特异性识别的适配体,结合g-C3N4的独特性质,构建了一种比值荧光纳米生物传感器,并用于水体中杀鲑气单胞菌的快速检测。同时,以嗜水气单胞菌鞭毛蛋白FlgE为靶标,通过SELEX筛选获得了高特异适配体。具体研究内容如下:（1）杀鲑气单胞菌适配体的筛选。利用Cell-SELEX筛选获得一个特异结合杀鲑气单胞菌的适配体群。经高通量测序及同源性分析,挑选了3条适配体进行结合性能的鉴定。其中,适配体A.s-2与杀鲑气单胞菌结合效果较好（Kd值为41.78±3.6 nM）,且具有较强的特异性。（2）基于类石墨相氮化碳的杀鲑气单胞菌比值荧光传感器的构建。该检测体系以捕获功能的适配体A.s-2连接DNA酶序列的核酸片段为探针,与g-C3N4纳米片非共价结合,构建了一种比值荧光纳米生物传感器。实验结果表明,该方法对杀鲑气单胞菌在103～107CFU/mL范围内的检测有良好的线性关系（R2=0.9655）,且检测下限为103 CFU/mL;并成功应用于患病斑马鱼中杀鲑气单胞菌的检测,为鱼类疾病诊断提供了一个高效、快速的方法。（3）嗜水气单胞菌鞭毛蛋白FlgE适配体的筛选。以嗜水气单胞菌鞭毛蛋白Flg E为靶标,利用筛选试剂盒进行SELEX筛选,得到具有高特异性和高亲和力的适配体。首先,利用构建的pET-28a-flgE重组质粒导入受体细胞,对诱导表达的重组蛋白FlgE进行纯化、浓缩。然后,利用筛选试剂盒以重组蛋白FlgE为靶标进行SELEX筛选,获得一个适配体群。通过高通量测序、亲和力和特异性的分析,得到一条对嗜水气单胞菌具有高特异和高亲和力（Kd值为40.3±2.8 nM）的适配体A.h-1,为后续发展基于适配体的嗜水气单胞菌的检测传感器奠定了基础。