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一、背景和目的
颅脑损伤是造成青年人死亡和伤残的重要原因之一，而且多数重型颅脑损伤后的患者面临不同程度的认知和运动功能障碍。目前在临床上，针对重型颅脑损伤除了神经外科手术治疗和术后康复治疗之外，尚缺乏特别有效的治疗手段。因此，如何改善重型颅脑损伤患者的预后，促进颅脑损伤后神经功能的恢复成为了亟需解决的问题。
研究表明，重型颅脑损伤后在损伤灶移植骨髓间充质干细胞能有效减轻神经损伤。但是，颅脑损伤后存在于损伤灶的炎性微环境不利于干细胞的存活和增殖，使得移植的干细胞在损伤灶的存活率较低，因此限制了干细胞的治疗效果。研究表明，钙蛋白酶的激活是引起颅脑损伤后炎症反应的主要机制之一。目前已有许多研究证实，在颅脑损伤后抑制钙蛋白酶的激活能减轻颅内的炎症反应，并起到一定的神经保护作用。因此，从理论上来说，在颅脑损伤后使用钙蛋白酶抑制剂能改善损伤灶的炎性微环境，提高移植的骨髓间充质干细胞的存活率并促进其发挥神经保护作用。本课题旨在探索钙蛋白酶的抑制剂MDL28170联合骨髓间充质干细胞植入重型颅脑损伤大鼠病灶内的治疗方法，观察骨髓间充质干细胞存活率、对神经损伤的保护作用及其潜在机制。
二、方法
选择体重为200-240克之间的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠作为实验对象。大鼠被随机分配至以下6个分组：（1）假手术组（Sham组），（2）TBI组（单纯颅脑损伤组），（3）对照组（颅脑损伤后30分钟损伤灶注射溶剂），（4）MDL28170治疗组（颅脑损伤后30分钟注射MDL28170），（5）骨髓间充质干细胞治疗组（颅脑损伤后24小时于损伤灶移植骨髓间充质干细胞），（6）MDL28170+骨髓间充质干细胞治疗组（颅脑损伤后30分钟注射MDL28170，24小时后损伤灶移植骨髓间充质干细胞）。
1.大鼠重型颅脑损伤模型的建立：
用10%的水合氯醛将大鼠麻醉后，在大鼠右侧顶骨钻一个直径约2.5mm的骨窗，在导管的引导下将一个50克的铁块于30cm高的地方自由落体落下，形成颅脑损伤。大鼠颅脑损伤打击30分钟后，在损伤灶中心注射1.0ul浓度为50mM的MDL28170。假手术组开骨窗后无颅脑损伤打击，对照组注射20%的DMSO溶剂。
2.骨髓间充质干细胞的制备和移植：
将大鼠麻醉后取股骨，从股骨中获取骨髓间充质干细胞。用含有GFP表达的目的质粒转染骨髓间充质干细胞，使其能自发绿色荧光。在颅脑损伤打击完成24小时后，每只大鼠于损伤灶中心注射1×105个骨髓间充质干细胞。
3.运用酶联免疫吸附测定法探究MDL28170在重型颅脑损伤后是否可以抑制损伤灶炎症因子的表达：
在大鼠注射MDL2817024小时后，将其处死，取得包含损伤灶在内的脑组织，使用ELISA kits来检测炎症因子（IL-1β,IL-6,TNF-α，IL-10）和炎症转录因子（NFκB）的水平。
4.运用免疫荧光染色法探究MDL28170对骨髓间充质干细胞在损伤灶存活和功能的影响：
在大鼠移植骨髓间充质干细胞7天后，获取骨髓间充质干细胞治疗组和MDL28170+骨髓间充质干细胞治疗组老鼠的脑组织，在显微镜下观察损伤灶内骨髓间充质干细胞的数量。对脑组织内骨髓间充质干细胞进行Ki67免疫荧光染色，评估骨髓间充质干细胞在损伤灶的分裂增殖能力。
5.运用尼氏染色检测重型颅脑损伤后各组别大鼠损伤灶的体积：
在骨髓间充质干细胞移植7天后获取大鼠脑组织，运用尼氏染色对大鼠脑冠状切片进行染色，运用ImageJ软件检测和分析各组大鼠脑组织损伤灶的体积。
6.使用改良神经功能评分来评估各组大鼠重型颅脑损伤后的神经功能修复情况：
在重型颅脑损伤模型建立后第7，14和28天对各组大鼠进行行为学检测，使用改良神经功能评分来评估各组大鼠的神经损伤和修复情况。
7.运用免疫印迹法检测重型颅脑损伤后MDL28170对损伤灶内细胞凋亡和炎症反应的影响：
在大鼠重型颅脑损伤模型建立和注射MDL2817024小时后获取脑组织，运用免疫印迹法检测损伤灶脑组织Bcl2，Bax，NFκb和p-Iκb的表达水平，评估MDL28170对细胞凋亡和炎症反应的影响。
8.运用免疫荧光染色法探究重型颅脑损伤后MDL28170对脑内小胶质细胞的影响：
在大鼠注射MDL2817024小时后处死大鼠，对大鼠脑冠状切片进行Iba1免疫荧光染色，从而探究MDL28170在重型颅脑损伤后对内源性小胶质细胞的影响。
三、结果
1.在重型颅脑损伤急性期使用MDL28170治疗可以有效减少炎症因子的表达：
在大鼠重型颅脑损伤模型建立成功后30分钟，在损伤灶注射MDL28170或0.5%DMSO作为对照试剂。使用实时荧光定量核酸扩增检测系统（qPCR,Real-time QuantitativePCR DetectingSystem）来检测Capn1基因的表达情况，用酶联免疫吸附测定（ELISA,enzyme linked immunosorbent assay）来检测炎症因子的表达。结果显示，MDL28170能有效抑制Capn1基因的表达，使其表达量降低接近一半，即证明了MDL28170在损伤灶对钙蛋白酶的抑制作用。同时，跟对照组相比，IL-1β,IL-6,TNF-α等促炎因子和转录因子NFκB的表达水平显著降低，而抗炎因子IL-10的表达水平显著增加。这些数据都证明了在重型颅脑损伤急性期MDL28170对损伤灶炎症的抑制作用。
2.MDL28170能提高移植的骨髓间充质干细胞在脑内的存活率：
在骨髓间充质干细胞移植7天后处死大鼠，用荧光显微镜观察大鼠的脑冠状切片，结果在损伤灶发现有自发绿色荧光的骨髓间充质干细胞，证明这些移植的细胞能在损伤处存活。跟骨髓间充质干细胞治疗组相比，MDL28170+骨髓间充质干细胞治疗组的大鼠脑切片内存活的干细胞数量显著增多，同时，大部分的存活干细胞呈现Ki67阳性，证明在用MDL28170预处理后，这些移植的骨髓间充质干细胞不仅能更多的存活，而且还保持了一定的细胞增殖分裂的能力。
3.重型颅脑损伤后注射MDL28170+骨髓间充质干细胞移植能减少损伤灶的体积：
在骨髓间充质干细胞移植7天后处死大鼠，将大鼠的脑冠状切片进行尼氏染色（Cresyl violet stain）。研究发现，骨髓间充质干细胞治疗组大鼠的损伤灶体积百分比为7.66%，明显小于对照组的10.36%，而MDL28170治疗组大鼠的脑损伤灶体积百分比为8.3%，经统计认为与对照组之间的差异无统计学意义。而且，MDL28170+骨髓间充质干细胞治疗组的大鼠脑损伤灶体积百分比为5.1%，与骨髓间充质干细胞治疗组相比也有显著差异，提示移植骨髓间充质干细胞能明显缩小重型颅脑损伤后的损伤灶体积，并且MDL28170能促进骨髓间充质干细胞对重型颅脑损伤的治疗作用。
4.MDL28170+骨髓间充质干细胞移植治疗能提高重型颅脑损伤后的神经功能修复：
在大鼠建立重型颅脑损伤模型后第7，14，28天，使用改良神经功能评分（Modified neurological severity scores,mNSS）来评估大鼠神经功能的恢复情况。骨髓间充质干细胞治疗组和MDL28170治疗组的大鼠的三次评分分别为9.33，7.67，6.33和9.50，7.83，6.17，与TBI组的评分12.83，10.17，8.67和对照组的评分12.67，9.83，8.17相比明显降低，表明大鼠的神经功能得到了显著的恢复。在颅脑损伤模型建立后第28天，MDL28170+骨髓间充质干细胞治疗组的大鼠的评分降低为3.67，与骨髓间充质干细胞治疗组和MDL28170治疗组的6.33和6.17相比有显著差异，表明MDL28170+骨髓间充质干细胞联合治疗能长期有效地提高大鼠重型颅脑损伤后的神经功能恢复情况。
5.MDL28170能抑制重型颅脑损伤后的细胞凋亡和NFκb-Iκb信号通路：
为了探究MDL28170提高骨髓间充质干细胞治疗重型颅脑损伤疗效的机制，使用Western blot免疫印迹法来研究与细胞凋亡和炎症的相关指标。结果显示，跟对照组相比，MDL28170治疗组的Bcl2蛋白含量显著增加，而Bax蛋白的数量大大减少，证明MDL28170能抑制颅脑损伤后的细胞凋亡。同时，实验结果还显示NFκb的下游蛋白p-Iκb的表达量也明显减少，说明NFκb-Iκb信号通路被抑制，证明MDL28170确实能在颅脑损伤后对炎症进行抑制。
四、结论
1.在大鼠重型颅脑损伤模型建立之后，先予MDL28170预处理，再移植骨髓间充质干细胞于损伤灶，能显著提高骨髓间充质干细胞在损伤灶的存活率和功能，明显减小损伤灶的体积，促进脑组织的修复，并提高了大鼠的神经功能恢复。
2.重型颅脑损伤后使用MDL28170治疗能够抑制NFκb-Iκb信号通路，从而减少炎症因子的表达，抑制损伤灶内的炎症反应。同时，MDL28170还能抑制重型颅脑损伤后脑内小胶质细胞的激活，减少细胞凋亡，最终改善损伤灶的炎性微环境，从而增强损伤灶内骨髓间充质干细胞对重型颅脑损伤大鼠的神经保护作用。
颅脑损伤是造成青年人死亡和伤残的重要原因之一，而且多数重型颅脑损伤后的患者面临不同程度的认知和运动功能障碍。目前在临床上，针对重型颅脑损伤除了神经外科手术治疗和术后康复治疗之外，尚缺乏特别有效的治疗手段。因此，如何改善重型颅脑损伤患者的预后，促进颅脑损伤后神经功能的恢复成为了亟需解决的问题。
研究表明，重型颅脑损伤后在损伤灶移植骨髓间充质干细胞能有效减轻神经损伤。但是，颅脑损伤后存在于损伤灶的炎性微环境不利于干细胞的存活和增殖，使得移植的干细胞在损伤灶的存活率较低，因此限制了干细胞的治疗效果。研究表明，钙蛋白酶的激活是引起颅脑损伤后炎症反应的主要机制之一。目前已有许多研究证实，在颅脑损伤后抑制钙蛋白酶的激活能减轻颅内的炎症反应，并起到一定的神经保护作用。因此，从理论上来说，在颅脑损伤后使用钙蛋白酶抑制剂能改善损伤灶的炎性微环境，提高移植的骨髓间充质干细胞的存活率并促进其发挥神经保护作用。本课题旨在探索钙蛋白酶的抑制剂MDL28170联合骨髓间充质干细胞植入重型颅脑损伤大鼠病灶内的治疗方法，观察骨髓间充质干细胞存活率、对神经损伤的保护作用及其潜在机制。
二、方法
选择体重为200-240克之间的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠作为实验对象。大鼠被随机分配至以下6个分组：（1）假手术组（Sham组），（2）TBI组（单纯颅脑损伤组），（3）对照组（颅脑损伤后30分钟损伤灶注射溶剂），（4）MDL28170治疗组（颅脑损伤后30分钟注射MDL28170），（5）骨髓间充质干细胞治疗组（颅脑损伤后24小时于损伤灶移植骨髓间充质干细胞），（6）MDL28170+骨髓间充质干细胞治疗组（颅脑损伤后30分钟注射MDL28170，24小时后损伤灶移植骨髓间充质干细胞）。
1.大鼠重型颅脑损伤模型的建立：
用10%的水合氯醛将大鼠麻醉后，在大鼠右侧顶骨钻一个直径约2.5mm的骨窗，在导管的引导下将一个50克的铁块于30cm高的地方自由落体落下，形成颅脑损伤。大鼠颅脑损伤打击30分钟后，在损伤灶中心注射1.0ul浓度为50mM的MDL28170。假手术组开骨窗后无颅脑损伤打击，对照组注射20%的DMSO溶剂。
2.骨髓间充质干细胞的制备和移植：
将大鼠麻醉后取股骨，从股骨中获取骨髓间充质干细胞。用含有GFP表达的目的质粒转染骨髓间充质干细胞，使其能自发绿色荧光。在颅脑损伤打击完成24小时后，每只大鼠于损伤灶中心注射1×105个骨髓间充质干细胞。
3.运用酶联免疫吸附测定法探究MDL28170在重型颅脑损伤后是否可以抑制损伤灶炎症因子的表达：
在大鼠注射MDL2817024小时后，将其处死，取得包含损伤灶在内的脑组织，使用ELISA kits来检测炎症因子（IL-1β,IL-6,TNF-α，IL-10）和炎症转录因子（NFκB）的水平。
4.运用免疫荧光染色法探究MDL28170对骨髓间充质干细胞在损伤灶存活和功能的影响：
在大鼠移植骨髓间充质干细胞7天后，获取骨髓间充质干细胞治疗组和MDL28170+骨髓间充质干细胞治疗组老鼠的脑组织，在显微镜下观察损伤灶内骨髓间充质干细胞的数量。对脑组织内骨髓间充质干细胞进行Ki67免疫荧光染色，评估骨髓间充质干细胞在损伤灶的分裂增殖能力。
5.运用尼氏染色检测重型颅脑损伤后各组别大鼠损伤灶的体积：
在骨髓间充质干细胞移植7天后获取大鼠脑组织，运用尼氏染色对大鼠脑冠状切片进行染色，运用ImageJ软件检测和分析各组大鼠脑组织损伤灶的体积。
6.使用改良神经功能评分来评估各组大鼠重型颅脑损伤后的神经功能修复情况：
在重型颅脑损伤模型建立后第7，14和28天对各组大鼠进行行为学检测，使用改良神经功能评分来评估各组大鼠的神经损伤和修复情况。
7.运用免疫印迹法检测重型颅脑损伤后MDL28170对损伤灶内细胞凋亡和炎症反应的影响：
在大鼠重型颅脑损伤模型建立和注射MDL2817024小时后获取脑组织，运用免疫印迹法检测损伤灶脑组织Bcl2，Bax，NFκb和p-Iκb的表达水平，评估MDL28170对细胞凋亡和炎症反应的影响。
8.运用免疫荧光染色法探究重型颅脑损伤后MDL28170对脑内小胶质细胞的影响：
在大鼠注射MDL2817024小时后处死大鼠，对大鼠脑冠状切片进行Iba1免疫荧光染色，从而探究MDL28170在重型颅脑损伤后对内源性小胶质细胞的影响。
三、结果
1.在重型颅脑损伤急性期使用MDL28170治疗可以有效减少炎症因子的表达：
在大鼠重型颅脑损伤模型建立成功后30分钟，在损伤灶注射MDL28170或0.5%DMSO作为对照试剂。使用实时荧光定量核酸扩增检测系统（qPCR,Real-time QuantitativePCR DetectingSystem）来检测Capn1基因的表达情况，用酶联免疫吸附测定（ELISA,enzyme linked immunosorbent assay）来检测炎症因子的表达。结果显示，MDL28170能有效抑制Capn1基因的表达，使其表达量降低接近一半，即证明了MDL28170在损伤灶对钙蛋白酶的抑制作用。同时，跟对照组相比，IL-1β,IL-6,TNF-α等促炎因子和转录因子NFκB的表达水平显著降低，而抗炎因子IL-10的表达水平显著增加。这些数据都证明了在重型颅脑损伤急性期MDL28170对损伤灶炎症的抑制作用。
2.MDL28170能提高移植的骨髓间充质干细胞在脑内的存活率：
在骨髓间充质干细胞移植7天后处死大鼠，用荧光显微镜观察大鼠的脑冠状切片，结果在损伤灶发现有自发绿色荧光的骨髓间充质干细胞，证明这些移植的细胞能在损伤处存活。跟骨髓间充质干细胞治疗组相比，MDL28170+骨髓间充质干细胞治疗组的大鼠脑切片内存活的干细胞数量显著增多，同时，大部分的存活干细胞呈现Ki67阳性，证明在用MDL28170预处理后，这些移植的骨髓间充质干细胞不仅能更多的存活，而且还保持了一定的细胞增殖分裂的能力。
3.重型颅脑损伤后注射MDL28170+骨髓间充质干细胞移植能减少损伤灶的体积：
在骨髓间充质干细胞移植7天后处死大鼠，将大鼠的脑冠状切片进行尼氏染色（Cresyl violet stain）。研究发现，骨髓间充质干细胞治疗组大鼠的损伤灶体积百分比为7.66%，明显小于对照组的10.36%，而MDL28170治疗组大鼠的脑损伤灶体积百分比为8.3%，经统计认为与对照组之间的差异无统计学意义。而且，MDL28170+骨髓间充质干细胞治疗组的大鼠脑损伤灶体积百分比为5.1%，与骨髓间充质干细胞治疗组相比也有显著差异，提示移植骨髓间充质干细胞能明显缩小重型颅脑损伤后的损伤灶体积，并且MDL28170能促进骨髓间充质干细胞对重型颅脑损伤的治疗作用。
4.MDL28170+骨髓间充质干细胞移植治疗能提高重型颅脑损伤后的神经功能修复：
在大鼠建立重型颅脑损伤模型后第7，14，28天，使用改良神经功能评分（Modified neurological severity scores,mNSS）来评估大鼠神经功能的恢复情况。骨髓间充质干细胞治疗组和MDL28170治疗组的大鼠的三次评分分别为9.33，7.67，6.33和9.50，7.83，6.17，与TBI组的评分12.83，10.17，8.67和对照组的评分12.67，9.83，8.17相比明显降低，表明大鼠的神经功能得到了显著的恢复。在颅脑损伤模型建立后第28天，MDL28170+骨髓间充质干细胞治疗组的大鼠的评分降低为3.67，与骨髓间充质干细胞治疗组和MDL28170治疗组的6.33和6.17相比有显著差异，表明MDL28170+骨髓间充质干细胞联合治疗能长期有效地提高大鼠重型颅脑损伤后的神经功能恢复情况。
5.MDL28170能抑制重型颅脑损伤后的细胞凋亡和NFκb-Iκb信号通路：
为了探究MDL28170提高骨髓间充质干细胞治疗重型颅脑损伤疗效的机制，使用Western blot免疫印迹法来研究与细胞凋亡和炎症的相关指标。结果显示，跟对照组相比，MDL28170治疗组的Bcl2蛋白含量显著增加，而Bax蛋白的数量大大减少，证明MDL28170能抑制颅脑损伤后的细胞凋亡。同时，实验结果还显示NFκb的下游蛋白p-Iκb的表达量也明显减少，说明NFκb-Iκb信号通路被抑制，证明MDL28170确实能在颅脑损伤后对炎症进行抑制。
四、结论
1.在大鼠重型颅脑损伤模型建立之后，先予MDL28170预处理，再移植骨髓间充质干细胞于损伤灶，能显著提高骨髓间充质干细胞在损伤灶的存活率和功能，明显减小损伤灶的体积，促进脑组织的修复，并提高了大鼠的神经功能恢复。
2.重型颅脑损伤后使用MDL28170治疗能够抑制NFκb-Iκb信号通路，从而减少炎症因子的表达，抑制损伤灶内的炎症反应。同时，MDL28170还能抑制重型颅脑损伤后脑内小胶质细胞的激活，减少细胞凋亡，最终改善损伤灶的炎性微环境，从而增强损伤灶内骨髓间充质干细胞对重型颅脑损伤大鼠的神经保护作用。