[背景和目的]生物材料（biomaterial）,也被称为生物医用材料（biomedical material）,是指一类能对机体的细胞、组织和器官进行诊断、治疗、替代、修复、诱导再生或者增进其功能的特殊材料。随着科技的不断发展,生物材料植入已经成为现代医学诊疗过程中不可或缺的一部分;然而,生物材料植入又是一把双刃剑,在给患者带来显著效益的同时,也增加了感染的风险。生物材料植入感染（biomaterial centered infection,BCI）已经成为慢性难治性医院内感染,有报道占院内感染的50%。生物膜被定义为细菌黏附于生命或非生命物表面,并被自身分泌的胞外多聚物质（Extra polymeric substance,EPS）所包裹而形成的高度复杂的多细胞复合体。EPS是所有生物膜的基本结构特征,包括蛋白质、多糖及核酸等。生物材料植入增加了细菌入侵机体的途径,同时降低了诱发感染的最低细菌数量;医用生物材料作为异物不仅影响机体的免疫机制,还能为游离细菌提供粘附位点,促进细菌生物膜（bacterialbiofilm,BF）形成。生物材料表面一旦形成生物膜,膜内细菌能抵御抗生素及机体免疫系统清除,导致感染反复发作、迁延不愈,是临床诊疗过程中最常见、最严重的并发症之一。大肠杆菌（E.coli）是革兰氏阴性、杆状兼性厌氧细菌,位于温血动物胃肠道中,是共生菌,一般情况下不会导致机体感染;另外,大肠杆菌在土壤及水中也能存活,特殊情况下也会造成机体感染。比如:第一,当机体皮肤和粘膜破坏时,可随生物材料植入进入机体,并黏附在材料表面形成生物膜;第二,外科手术过程中控制性降压、失血性休克以及长期禁食、胃肠外营养患者,肠道细菌移位可造成菌血症,血液中的细菌为生物材料表面生物膜形成提供菌源。研究显示大肠杆菌占肠道细菌移位细菌的半数以上;研究也显示心脏瓣膜置换术等相关术后生物材料感染中,大肠杆菌的检出率大约为3-10%。环二鸟苷酸（cyclic diguanylate monophsphate,c-di-GMP）是细菌中普遍存在的第二信使。研究发现,环二鸟苷酸调节细菌多种功能,包括:鞭毛运动、黏附、细胞周期起始和调控、毒力因子合成以及生物膜形成等。环二鸟苷酸对许多细菌最重要的影响是决定细菌“生活方式”,尤其是控制细菌在浮游运动状态和固着、生物膜状态之间转换。一般来讲,细菌细胞中环二鸟苷酸浓度水平增高可抑制鞭毛运动性,并增加胞外多聚物质（extracellularpolymeric substances,EPS）合成,从而导致生物膜形成;低浓度水平环二鸟苷酸增加细菌运动性,并分散生物膜。由此推测,环二鸟苷酸调节鞭毛运动介导细菌生物膜形成。细菌体内环二鸟苷酸水平依靠双鸟苷酸环化酶（diguanylate cyclases,DGCs）和磷酸二酯酶（phosphodiesterases,PDEs）共同维持平衡。环二鸟苷酸通过调节鞭毛制动蛋白YcgR从而抑制鞭毛运动,而调节YcgR相关的双鸟苷酸环化酶DGCs主要包括DgcE和DgcQ。研究发现,ΔpdeH的大肠杆菌菌株运动性大幅下降,但ΔdgcE、ΔdgcQ和ΔpdeH三基因同时缺失的菌株则可恢复与野生型菌株相近的运动能力。由此可见,dgcE和dgcQ与大肠杆菌鞭毛运动调节密切相关。鉴于环二鸟苷酸信号在细菌中高度保守,且环二鸟苷酸促进生物膜形成;因此,与其代谢相关的酶可能是干扰细菌生物膜形成极具吸引力的靶点,尤其是生成c-di-GMP的双鸟苷酸环化酶（DGCs）。阐明环二鸟苷酸dgcE、dgcQ信号在细菌生物膜中的作用,即调节核苷酸水平或干扰信号通路可能抑制生物膜形成或促进生物膜分散。基因敲除技术是研究基因功能的有效工具。通过同源重组技术想要获得突变株的筛选,将耗费大量的时间和精力;CRISPR/Cas9系统作为一种高效的基因组编辑技术,具有制备简单、靶向性强、成本低和脱靶率低等诸多优势,极大地促进了基因功能研究。本研究采用CRISPR/Cas9技术构建大肠杆菌ATCC25922菌株dgcE、dgcQ基因敲除菌株,在前期建立生物材料表面生物膜模型基础上,采用激光共聚焦、扫描电镜等技术,探讨大肠杆菌dgcE、dgcQ对生物材料表面细菌生物膜形成的影响;通过构建大鼠菌血症模型,探讨大鼠体内不同大肠杆菌的清除以及生物材料表面细菌生物膜形成的影响;揭示防治生物材料表面大肠杆菌生物膜形成的有效分子靶标,为防治生物材料大肠杆菌相关感染提供实验依据。[方法]本研究分为三个部分:1.应用Crispr/Cas9技术构建大肠杆菌dgcE、dgcQ基因敲除菌株:以大肠杆菌ATCC25922为研究对象,使用dgcE、dgcQ引物序列完成相应基因PCR扩增检测,进一步完成dgcE、dgcQ基因序列Sanger测序检测,并与NCBI序列对比;参考gRNA设计原则完成gRNA设计,参考CRISPR-Vector载体方法构建目标序列载体。完成大肠杆菌ATCC25922（E.coli）感受态制备,参考电转感受态制备方法制备大肠杆菌ATCC25922（E.coli）感受态,CRISPR-Vector转化至大肠杆菌ATCC25922（E.coli）电转感受态,涂布至筛选培养基,培养3-5天,kan&spe双抗性板完成基因编辑菌株筛选。菌株PCR鉴定,PCR序列sanger测序验证DgcQ基因和DgcE基因分别敲除结果,DgcQ基因和DgcE基因敲除菌株分别保存。2.测定大肠杆菌dgcE、dgcQ在细菌生物学表型变化及在生物材料表面细菌生物膜形成中的作用:①、采用测定菌液光密度法绘制大肠杆菌ATCC25922、ATCC25922ΔdgcE和ATCC25922ΔdgcQ生长曲线,测量细菌在半固体培养基上的运动环直径大小反应细菌运动能力。探讨dgcE、dgcQ在细菌生物学表型变化中的作用。②、以三株大肠杆菌（ATCC25922、ATCC25922ΔdgcE和ATCC25922ΔdgcQ）为实验菌株,建立PVC材料表面细菌生物膜体外模型。采用半定量方法检测大肠杆菌生物膜形成能力,应用激光共聚焦（CLSM）动态观察PVC材料表面大肠杆菌生物膜形成过程、细菌群落数量以及细菌生物膜厚度等;应用扫描电镜（SEM）观察PVC材料表面大肠杆菌细菌生物膜表面结构。探讨dgcE、dgcQ在生物材料表面细菌生物膜形成中的作用。3.大鼠体内大肠杆菌的清除以及生物材料表面细菌生物膜的形成:SPF级健康雄性SD大鼠随机分为四组:空白对照组,ATCC25922组,ATCC25922ΔdgcE组和ATCC25922ΔdgcQ组。水合氯醛联合利多卡因麻醉后,通过尾静脉注射菌液建立菌血症模型,并经大鼠腹部正中切口将PVC材料放入腹膜腔。在24小时后处死大鼠,严格无菌条件下取门静脉血进行白细胞计数、PCT检测以及血液中细菌数测定;琼脂平板上的菌落行革兰氏染色鉴定,同时行菌落PCR鉴定;将体内生物材料一片用于细菌培养,再行菌落PCR鉴定;SEM观察体内材料表面生物膜结构;HE染色观察肺组织损伤情况。[结果]1.成功构建大肠杆菌dgcE、dgcQ基因敲除菌株:菌落PCR及Sanger测序结果表明,dgcE、dgcQ两个基因内部序列已被删除,且无相应卡那霉素及大观霉素抗性基因,基因被成功敲除。2.dgcE、dgcQ在大肠杆菌生物学表型变化及生物材料表面细菌生物膜形成中的作用:①、ATCC25922、ATCC25922ΔdgcE、ATCC25922ΔdgcQ三株大肠杆菌在TSB培养基中生长无明显差异（P>0.05）;②、相对于ATCC25922,ATCC25922ΔdgcE 及 ATCC25922ΔdgcQ 运动能力明显增加（P<0.05）;并且ΔdgcQ比ΔdgcE基因敲除株运动能力更强（P<0.05）。③、在4-8h时基因敲除菌株生物膜形成能力大于标准菌株,且在8h时具有明显统计学意义（P<0.05）。大肠杆菌ATCC25922生物膜形成峰值时间为12h,但基因敲除菌株形成生物膜峰值时间为8h,较标准株提前;④、三种菌株在4-8h生长动力学呈上升趋势,超过8h后其生长动力学呈下降趋势;且各个时间点大肠杆菌ATCC25922标准菌株生长动力学明显大于基因突变菌株,在8h、12h、24h时与ΔdgcQ相比差异具有统计学意义（P<0.5）;⑤、大肠杆菌ATCC25922单位面积细菌菌落数大于ΔdgcE及ΔdgcQ,差异具有统计学意义（P<0.05）;但基因突变菌株之间无明显差异（P>0.05）;⑥、大肠杆菌ATCC25922菌株生物膜厚度较基因敲除株厚（P<0.05）;且在8h时,ATCC25922-ΔdgcE 较 ATCC25922-ΔdgcQ 厚,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.大鼠体内大肠杆菌的清除以及生物材料表面细菌生物膜的形成:①、菌血症模型组白细胞数较空白对照组明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;但三组菌血症模型之间无明显差异（P>0.05）;②、对于血浆中降钙素原（PCT）水平,菌血症模型组与对照组相比明显增加,差异具有统计学意义（P<0.05）;三个菌血症模型组之间两两比较具有统计学意义（P<0.05）;③、在感染24h时,ATCC25922标准菌株组的活菌数量最高,达到3X103CFU/ml。菌血症动物模型组与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）,且ATCC25922-ΔdgcE组、ATCC25922-ΔdgcQ组与ATCC25922标准菌株组相比差异有统计学意义（P<0.05）,二者间比较差异无统计学意义;④、ATCC25922标准株、ATCC25922-ΔdgcE及ATCC25922-ΔdgcQ组生物材料表面细菌数均较对照组显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;同时,ATCC25922标准菌株组材料表面细菌数较ATCC25922-ΔdgcE 及 ATCC25922-ΔdgcQ 组多,与 ATCC25922-ΔdgcQ 组相比差异具有统计学意义（P<0.05）;⑤、ATCC25922标准菌株组较ATCC25922-ΔdgcE组、ATCC25922-ΔdgcQ组对大鼠肺组织的损伤重。[结论]1.运用CRISPR/Cas9技术可成功构建大肠杆菌dgcE、dgcQ基因敲除菌株,为后续相应基因功能研究奠定基础;dgcE、dgcQ基因敲除能增强大肠杆菌运动能力,但不影响细菌生长;2.dgcE和dgcQ在生物膜形成过程中具有双重功能,即:低水平c-di-GMP对于早期附着是重要的,而在成熟生物膜中需要高水平c-di-GMP以促进基质产生,这与生物膜形成过程中的黏附、聚集相一致;dgcE和dgcQ基因敲除影响胞外多聚物质产生,导致生物膜结构不稳定。因此,可能是生物材料植入感染潜在治疗靶标。3.大肠杆菌dgcE和dgcQ基因缺失,引起c-di-GMP水平下降,导致大鼠免疫系统对细菌清除效率增加;并且在大鼠菌血症期间,大鼠体内生物材料表面生物膜形成降低,以及对大鼠肺组织损伤减轻。