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黄萎病(Verticillium dahliae)是我国乃至世界棉花生产上的重要病害,寄主的抗病机制不清是病害有效控制的瓶颈问题。本文通过对抗病品种和感病品种经黄萎病菌诱导前后根部蛋白的磷酸化分析,获得一个差异显著的类受体蛋白激酶GhPR5K。利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术验证其在棉花抗黄萎病过程中的功能,并进一步分析其防御反应机制,筛选其互作的蛋白。取得的主要结果如下:1.利用黄萎病菌Vd080侵染抗病品种中植棉2号和感病品种冀棉11号,进行修饰蛋白质组定量分析,共检测到1716个磷酸化蛋白,其中639个显著差异的蛋白,主要涉及到植物激素信号转导途径、MAPK信号通路、AMPK信号通路、植物病原互作及mTOR信号通路等。其中,Gh_D04G1868在中植棉2号处理组与对照组间的差异倍数最高,达到了12.69,而在冀棉11号处理组与对照组间的差异不显著。同源性比较发现Gh_D04G1868与拟南芥的病程相关蛋白激酶AtPR5K相似性达到了84.7%,因此将其命名为GhPR5K。进一步分析发现,接种Vd080后,GhPR5K在中植棉2号中的表达量大幅度提高,初步推断GhPR5K参与了棉花对黄萎病的防御反应。2.基因克隆得到了GhPR5K全长。其CDS全长1887bp,编码628个氨基酸,位于Dt_chr12染色体上。蛋白序列分析表明,在252-274碱基区内有一个跨膜区,N端有一个信号肽,C端有一段丝氨酸/苏氨酸富集区域。3.利用VIGS技术,成功地在棉花中沉默该基因。接种试验表明,沉默植株叶片大量变黄、萎蔫,甚至脱落、枯死;而对照植株叶片变黄、萎蔫明显较轻,没有严重的脱落和枯死植株。接种后20d和25d,TRV:GhPR5K的病情指数分别为19.5和54.2,显著高于对照植株的10.3和25.2,表明GhPR5K正调控棉花对黄萎病的抗性。进一步遗传转化烟草,获得在选择性培养基上表现为阳性的烟草植株12株。4.将TRV:00和TRV:GhPR5植株接种Vd080,观察其防御反应,分析防御相关基因的表达量。结果表明,与TRV:00植株相比,TRV:GhPR5K植株叶片中活性氧爆发减少、死细胞数较多,茎部木质化程度减弱,茎部定殖有更多的棉花黄萎病菌,维管束褐变程度显著加重。qRT-PCR分析表明,与TRV:00相比,PR基因在TRV:GhPR5K植株均显著下降,4CL、CHI、PAL、POD、CAD、C4H1最高分别下降70.95%、43.57%、55.33%、43.47%、78.09%和71.89%。表明TRV:GhPR5K植株对黄萎病的防御反应明显减弱。5.通过酵母双杂交实验筛选出GhPR5K的互作蛋白DNA J,生物信息学分析表明,该蛋白N段有一个22个氨基酸长度的信号肽、一个跨膜结构、C段有一个蛋白激酶结构域,预测该结构域可能是为GhPR5K蛋白互作的主要结构域。上述研究部分明确了GhPR5K抗黄萎病的分子机制,获得的GhPR5K超表达转基因烟草及互作蛋白仍需要进一步的检测、验证和分析。